一株拮抗细菌A2的分离、鉴定及其对小麦白粉病的防治效果

摘要

本文从样品采集、菌株分离保存、活性筛选、菌种鉴定、生物学特性、基础发酵培养基的选择、作用机理、小麦白粉病防治效果等多个方面对分离自保护性耕作农田土样的菌株A2进行了研究。主要结论如下： (1)从保护性耕作农田采集土样，选用不同的分离培养基，采用土壤稀释及平板划线法分离出38个单菌落：以番茄灰霉病菌和水稻稻瘟病菌为指示菌，对峙生长法初筛获得具有拮抗作用的菌株12株。10代继代后，重新测定活性并结合管碟法进行复筛，对指示病原菌仍具有较强抑菌作用且较稳定的只有细菌菌株A2。 (2)室内平板对峙结果表明，菌株A2抑菌谱广，对20种病原真菌均表现出抑制作用。但对不同的植物病原真菌抑菌效果不同；抑制率在29.00％～86.00％之间，其中对番茄灰霉病菌、水稻稻瘟病菌的抑菌效果最好，抑制率达85.61％、81.82％；抑菌带宽平均可达17.00mm、15.83mm。 (3)运用形态、生理生化以及分子生物学方法对菌株A2进行了鉴定。根据A2菌株的形态、生理生化特性以及16S rDNA的序列比对结果，鉴定菌株A2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的一株菌株。其主要特性为：菌体杆状，内生芽孢、芽孢卵圆形，无伴孢晶体，具鞭毛，革兰氏染色阳性；在LB平板培养基上菌落呈淡黄色、无规则、突起、边缘不整齐、表面粗糙有褶皱、不透明、黏性；兼性厌氧，接触酶反应、V-P(Vogos-Proskuer)测定为阳性、能利用柠檬酸盐生长。PCR扩增获得菌株A2的16S rDNA序列全长为1437bp(GenBank序列登录号为EU567068)。利用BLA1ST软件将测得的基因序列与GenBank数据库进行序列比对分析，利用DNAMAN软件进行同源性比较和进化树绘制。结果表明菌株A2与B.subtilis(AY881643)序列相似性最高、遗传距离最小，分别为99.7％和0.003，并且在系统进化树当中与枯草芽孢杆菌处于一个分支。 (4)菌株A2在牛肉膏蛋白胨培养基中生长迅速，14h即达到稳定期(28℃，180rpm)。最适生长pH为7，在26-35℃条件下，生长良好，最适生长温度为28℃，较适宜的摇瓶装液比为1：10(250mL三角瓶装25mL培养液)。50mL装液量、28℃，180rpm摇瓶培养最适基础发酵培养基配方：蔗糖30g，蛋白胨10g，酵母膏5g，KH2PO1 4.5g，CaCO3 2g，(NH4)2SO12.5g，蒸馏水1000mL。 (5)在离体条件下，对水稻稻瘟、苹果树腐烂、小麦根腐、棉花枯萎病菌菌丝生长、致畸作用等进行了研究。结果发现，菌株A2发酵上清液对4种病菌表现出了强烈的抑制作用，平均抑菌圈直径分别为30.50mm、30.00mm、29.76mm、21.20mm。其中对苹果树腐烂病菌的抑制率最高83.60％，随着发酵上清液稀释倍数的增加，抑制作用下降。但是直到7d仍具有20.00％以上的抑制率。证明其代谢产物也具有较强的抑菌效果。该菌可以致使病原菌菌丝生长形态异常，出现菌丝分支加剧、膨大、生成圆珠形囊状体和细胞质溢出而使菌丝体崩溃染色较深等现象。 (6)温室小麦活体生物测定中，菌株A2的发酵液及发酵上清液均表现出较好的防治效果(29.00％以上)；当菌液与上清液混合(发酵液)后其防治效果有加和作用。本文主要是研究了该菌对小麦白粉病的预防作用，发酵原液防治效果可达72.22％，发酵上清原液也有29.24％的防治效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1植物病害

1.2植物病害生物防治研究概况

1.2.1植物病害生物防治

1.2.2植物病害生物防治发展史

1.2.3拮抗微生物的种类

1.3芽孢杆菌防治植物病害的研究进展

1.3.1国外研究进展

1.3.2国内研究进展

1.4研究意义与目的

1.5技术路线

2拮抗菌的分离与筛选

2.1研究材料和试验仪器

2.1.1供试材料

2.1.2试验仪器

2.1.3试剂

2.1.4培养基配方

2.2试验方法

2.2.1细菌的分离、纯化及保存

2.2.2细菌的筛选

2.3结果与分析

2.3.1细菌的分离与纯化

2.3.2拮抗菌菌株的筛选

2.4讨论

3拮抗菌的鉴定

3.1材料

3.1.1供试材料

3.1.2试剂及溶液

3.1.3试验仪器

3.1.4培养基

3.2试验方法

3.2.1形态鉴定

3.2.2生理生化鉴定

3.2.3抗菌谱测定

3.3结果与分析

3.3.1形态特征

3.3.2生理生化特性

3.3.3抗菌谱

3.4讨论

4菌株A2的分子鉴定

4.1材料

4.1.1供试菌株

4.1.2培养基

4.1.3主要试剂和仪器

4.2试验方法

4.2.1 DNA的提取

4.2.2 16s rDNA的PCR扩增

4.2.3 DNA序列测定及分析

4.3结果与分析

4.4讨论

5菌株A2生物学特性研究

5.1材料

5.1.1供试菌株

5.1.2培养基

5.1.3试验仪器

5.1.4试剂

5.2试验方法

5.2.1菌株A2的生长曲线

5.2.2菌株A2生长的酸碱度

5.2.3菌株A2生长的温度

5.2.4菌株A2生长的通气量

5.2.5发酵培养基的选择

5.3结果与分析

5.3.1菌株A2的生长曲线

5.3.2菌株A2生长适宜的pH值

5.3.3菌株A2生长适宜的温度

5.3.4菌株A2生长适宜的通气量

5.3.5最适发酵培养基的选择

5.4讨论

6菌株A2对4种植物真菌病菌的拮抗作用研究

6.1材料

6.1.1供试材料

6.1.2培养基

6.1.3试剂

6.1.4仪器

6.2试验方法

6.2.1菌株A2发酵上清液的制备

6.2.2菌株A2对4种病原菌的平板拮抗作用测定

6.2.3发酵上清液对菌丝生长的影响

6.3结果

6.3.1菌株A2对4种病菌的平板拮抗作用

6.3.2菌株A2发酵上清液对菌丝生长的的抑制作用

6.4讨论

7菌株A2对小麦白粉病的防病效果

7.1材料

7.1.1供试材料

7.1.2发酵培养基

7.1.3试剂

7.1.4仪器

7.2试验方法

7.2.1小麦苗的培养

7.2.2菌株A2发酵液的制备

7.2.3发酵上清液的制备

7.2.4发酵培养基的筛选

7.2.5温室防治效果的测定

7.3结果

7.3.1培养基的筛选

7.3.2温室防效测定结果

7.4讨论

8主要结论

参考文献

附录

致谢