砷抗性全细胞传感器的构建与检测

摘要

利用抗重金属砷的大肠杆菌DH5a作为出发菌株，以萤火虫荧光素酶firefly luciferase(luc)基因为报告基因，构建成基因工程重组体。将重组体再导入大肠杆菌DH5a中，成功的构建出抗重金属砷的工程菌株，并研究了工程菌株的荧光强度与砷离子浓度的关系，以及工程菌的性质，以考察工程菌株用于快速检测重金属砷的可行性。同时为了减少本底表达、增加工程菌的灵敏度，对工程菌进行了改进。 采用聚合酶链式反应(PCR)从大肠杆菌DH5a基因组扩增得到重金属砷离子特异性启动子及调控蛋白O/P-arsR，以萤火虫荧光素酶fireflyluciferase(luc)基因为报告基因、pUC18为基础质粒，构建了萤火虫荧光素酶砷离子诱导表达载体pUC18-Luc-arsR。以大肠杆菌DH5a为宿主菌，采用化学转化感受态细胞转化法将pUC18-Luc-arsR导入大肠杆菌DH5a，成功构建砷离子检测工程菌株。工程菌株的研究结果如下： 1.工程菌pUC18-Luc-arsR.DH5a在培养基中加入不同浓度的AsIII、AsV进行诱导，当AsIII浓度小于10μM时，荧光强度随AsIII浓度增加而升高；当AsIII浓度在大于10μM时，荧光强度随AsIII浓度增加而下降的分布；当AsV浓度小于100μM时，荧光强度随AsIII浓度增加而升高；当AsV浓度在大于100μM时，荧光强度随AsV浓度增加而下降的分布。 2.分别采用10种重金属离子(Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Pb2+、Zn2+、Sn2+、Sb3+、Bi3+)对工程菌株进行诱导试验，通过测定荧光强度考察工程菌株对砷离子的特异性。工程菌株对砷以外的重金属离子基本没有响应，仅对砷产生明显的效应，说明工程菌株对砷离子具有较好的特异性。 3.当工程菌株砷离子的诱导浓度为1mM时，利用扫描能谱与液相色谱.电感耦合等离子体质谱仪(HPLC-ICP-MS)联用技术，对工程菌株的细胞表面与细胞内不同形态砷的含量进行测定。细胞表面的砷含量：亚砷酸钠诱导4h比诱导1h高，而砷酸三钠诱导4h比诱导1h高。细胞内部不同形态砷的含量变化：砷酸三钠诱导1h与诱导4h细胞内总砷的含量几乎相同，大约为38ppb，而诱导1h时AsV大于.AsIII的含量；诱导4h时，正好相反，AsIII大于AsV的含量；亚砷酸钠诱导1h比诱导4h砷的含量高。 4.为了降低本底表达，对重组质粒pUC18-Luc-arsR进行改进，在O/P-arsR序列后再引入一个O/P结构，构建了重组质粒pUC18-Luc-20/P-arsR，很大程度上降低了本底表达，提高了灵敏度。 实验表明，利用以萤火虫荧光素酶(luc)基因为报告基因的工程菌株pUC18-Luc-arsR.DH5a及改进的pUC18-Luc-20/P-arsR.DH5a有望建立起一种方便快捷的重金属砷的检测方法-微生物全细胞传感器法，具有很强的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1微生物细胞传感器

1.1微生物细胞传感器的结构

1.2微生物细胞传感器的类型

1.3微生物细胞传感器的构建

1.4中国在微生物细胞传感器领域的研究进展

2启动子

2.1启动子的特征

2.2启动子的分类

2.3启动子的作用机制

2.4启动子功能和结构研究的策略

2.5启动子克隆的方法

2.6启动子在环境中的应用

3项目的立题背景和研究意义

第二章砷全细胞传感器的构建及表达

1前言

2材料、试剂与仪器

2.1实验材料

2.2实验试剂

2.3实验仪器

3实验方法

3.1pUC18-Luc基础细胞传感器的构建与表达

3.2砷抗性全细胞传感器的构建

3.3工程菌pUC18-Luc-arsR的遗传稳定性测定

4结果与分析

4.1 pUC18-Luc构建的电泳结果

4.2 pUC18-Luc全细胞传感器诱导Luc表达结果

4.2砷抗性全细胞传感器(pUC18-Luc-arsR)构建的电泳结果

4.3砷抗性全细胞传感器诱导Luc的表达

4.4工程菌pUC18-Luc-ars的遗传稳定性

5小结

第三章工程菌株检测重金属砷的研究

1引言

2主要试剂

3实验方法

3.1耐受性检测

3.2诱导时间单因素对荧光表达强度影响

3.3浓度与诱导时间双因素对荧光表达强度的影响

3.4砷抗性全细胞传感器特异性的测定

3.5扫描电镜与能谱

3.6 HLPC-ICP-MS测细胞内不同形态砷的含量

3.7砷抗性全细胞传感器的改进

4结果

4.1耐受性检测

4.2诱导时间单因素对荧光表达强度影响

4.3浓度与诱导时间双因素对荧光表达强度的影响

4.4砷抗性全细胞传感器特异性的测定

4.5扫描电镜与能谱

4.6 HLPC-ICP-MS测细胞内不同形态砷的含量

4.7砷抗性全细胞传感器的改进

5.小结

第四章结论与展望

参考文献

附录1 我国生物传感器一览表

致谢