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1引言
1.1马传染性贫血病毒概述
1.1.1 EIAV认知历史和现状
1.1.2 EIAV形态结构和理化特性
1.1.3 EIAV的生物学特性
1.1.4 EIAV的致病性
1.2病毒的细胞受体
1.2.1病毒受体的本质
1.2.2病毒受体的特征
1.2.3受体介导病毒进入细胞
1.2.4病毒受体选择性剪接变异体在病毒感染中的作用
1.2.5病毒受体峡谷学说:
1.2.6病毒受体的研究方法
1.2.7病毒突变的累积可能最终改变其细胞嗜性
1.3马传染性贫血病毒细胞受体
1.4真核生物PRE-MRNA选择性剪接研究进展
1.4.1 MRNA前体剪接基本过程
1.4.2选择性剪接的基本形式
1.4.3选择性剪接基因及其剪接形式的识别
1.4.4选择性剪接的调节
1.4.5选择性剪接的功能与调控研究
1.5本研究的目的及意义
2.实验一马传染性贫血病毒受体选择性剪接变异体的发现及鉴定
2.1材料
2.1.1细胞
2.1.2质粒和菌株
2.1.3主要试剂及工具酶
2.1.4主要仪器
2.1.5培养基
2.2方法
2.2.1马白细胞的分离与培养
2.2.2选择性剪接变异体的发现
2.2.3选择性剪接变异体的鉴定
2.3结果
2.3.1选择性剪接变异体的发现结果
2.3.2选择性剪接变异体的鉴定结果
2.4讨论
3实验二马传染性贫血病毒受体选择性剪接变异体的准确定量
3.1材料
3.1.1菌株与质粒
3.1.2主要仪器
3.1.3主要试剂
3.2方法
3.2.1引物的设计
3.2.2目的基因的鉴定
3.2.3标准曲线的制作
3.2.4实时荧光定量检测方法的复合率及敏感性试验
3.2.5样品制备
3.2.6样品的检测
3.3结果
3.3.1目的基因的鉴定结果
3.3.2标准曲线的建立结果
3.3.3实时荧光定量检测方法的复合率及敏感性试验
3.3.4样品检测结果
3.4讨论
4实验三马传染性贫血病毒受体选择性剪接变异体的真核表达及其功能研究
4.1材料
4.1.1细胞与病毒
4.1.2质粒和血清
4.1.3酶、试剂
4.1.4主要仪器
4.1.5培养基
4.2方法
4.2.1引物设计
4.2.2真核表达质粒的构建
4.2.3真核表达质粒的提取和纯化
4.2.4真核转染
4.2.5间接免疫荧光检测目的蛋白在293、HELA细胞中的表达
4.2.6 WESTERN-BLOT检测目的蛋白在293细胞中的表达
4.2.7稳定表达ELR1及ELR1-IN蛋白的293细胞系的建立
4.2.8RT-PCR鉴定293-ELR1和293-ELR1-IN细胞系中目的基因的插入。
4.2.9病毒滴定实验确定病毒毒价
4.2.10间接免疫荧光检测稳定表达ELR1蛋白的293细胞系对EIAV的敏感性
4.2.11检测病毒载量的Real-Time RT-PCR标准品的制备
4.2.12在293-ELR1和293-ELR1-IN细胞上FDDV病毒复制水平检测
4.2.13可溶性受体对病毒感染细胞的影响
4.3结果
4.3.1重组真核表达质粒的构建
4.3.2间接免疫荧光检测各目的蛋白在细胞中表达结果
4.3.3 Western-Blot检测各目的蛋白在细胞中表达结果
4.3.4 RT-PCR鉴定目的基因在293细胞系的存在
4.3.5间接免疫荧光检测ELR1稳定转染的293细胞系对EIAV的敏感性
4.3.6病毒滴定实验确定病毒的毒价结果
4.3.7标准曲线的制作
4.3.8实时定量RT-PCR检测病毒在293-ELR1及293-ELR1-IN中的复制结果
4.3.9 RT酶活性检测病毒在293-ELR1及293-ELR1-IN中的复制
4.3.10RT酶活性检测可溶性受体对病毒感染细胞的影响
4.4讨论
5实验四马传染性贫血病毒受体基因原核表达
5.1材料
5.1.1菌株与质粒
5.1.2主要试剂及工具酶
5.1.3主要仪器
5.2方法
5.2.1引物设计
5.2.2重组表达质粒的构建
5.2.3重组表达质粒在E.clil中的表达及融合表达蛋白的分析
5.2.4表达蛋白的纯化及Western-blot分析
5.3结果
5.3.1重组表达质粒的构建
5.3.2基因片段诱导表达结果
5.3.3表达产物的Western-Blot检测
5.4讨论
6总体结论
7本研究的创新点
致谢
参考文献
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