高加索三叶草与白三叶草及其杂交胚离体培养技术的研究

摘要

三叶草属(Trifolium L.)植物是优良的一年生或多年生豆科牧草,具有固氮能力，可以提高土壤肥力、增加地面覆盖、控制杂草生长、保持土壤湿度、减少土壤侵蚀，是保持水土的好材料。高加索三叶草(T.ambiguum Bieb,)产量高、抗旱、抗寒能力强，但其固氮能力差。白三叶草(Zrepens L.)根瘤固氮能力强，但其根系浅，喜湿、喜暖。为了培育结合双亲优良特性的三叶草新种，本试验将引自新西兰的六倍体高加索三叶草与生长在内蒙古大兴安岭的四倍体野生白三叶草进行种间杂交。由于高加索三叶草和白三叶草亲缘关系较远，杂交过程中出现杂交不亲和、杂交胚败育、杂种不育的问题，通过杂交胚离体培养再回交的办法可有效克服这些障碍。本研究在前人对高加索三叶草和白三叶草特性研究的基础上，采用组织培养、细胞学和同工酶标记的方法对高加索三叶草与白三叶草及其杂交胚离体培养技术进行了研究。主要结果如下: 1.高加索三叶草核型公式是2n=6x=48=44m+4sm。属于2B型。白三叶草核型公式是2n=4x=32=22m+10sm(2Sat)，属于2A型。 2.高加索三叶草在MS+2,4.D0.25mg/L+6BA0.5mg/L+3％蔗糖的培养基上愈伤组织诱导生长最好。愈伤组织在MS+2,4.D0.2mg/L+6BA 1.0mg/L+2％蔗糖培养基上生长迅速，质地好。在MS+2,4.D 0.25mg/L+6BA 1.0mg/L，培养基上分化率为75％。白三叶草在MB+2,4-D0.75mg/L+6BA 2.0mg/L培养基上诱导出完整植株。 3.以高加索三叶草为母本、白三叶草为父本进行杂交。在花期8:00～9:00时授粉，授粉后12、13d取胚，用10％NaCIO灭菌6.5～7min，在不加任何外源激素的改良MS培养基上，胚萌发率最高，达8％。高频扩繁时，在附加2,4-D0.25mg/L、6BA0.50mg/L的培养基上可获得5％的较高萌发率。 4.高加索三叶草与白三叶草杂交后代的茎段最初接种于6BA浓度为2mg/L、2,4-D浓度为0.25mg/L，的培养基上，10d之后转接于6BA2mg/L、NAA0.5mg/L的培养基上，其愈伤生长较快、质量也较好。最适合根段和叶片愈伤诱导的培养基是6BA2mg/L+NAA0.5mg/L。 5.杂交后代愈伤组织POD同工酶酶谱带数介于双亲之间，继承了双亲的2条基带。酶谱表型偏向母本。杂交后代拥有1条特征带，而且大多数酶带加强，说明具有一定的杂种优势。 6.亲本之间的遗传相似系数是0.3333，杂交后代与母本的遗传相似系数为0.6667，与父本的遗传相似系数为0.5455，从酶蛋白水平上证明这是一个真实的杂种后代。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1三叶草属牧草国内外研究进展

1.2高加索三叶草与自三叶草的一般特性

1.3远缘杂交育种

1.3.1远缘杂交育种研究

1.3.2远缘杂交中存在的问题

1.3.3克服远缘杂交障碍的方法

1.4组织培养

1.5核型分析

1.6同工酶

1.6.1同工酶及同工酶标记的概况

1.6.2同工酶在物种亲缘关系鉴定方面的应用与发展

1.7本研究的目的及意义

1.7.1主要研究内容

1.7.2主要技术路线

2材料与方法

2.1试验材料与试验田概况

2.2试验方法

2.2.1高加索三叶草与白三叶草核型分析

2.2.2高加索三叶草与白三叶草再生体系的建立

2.2.3杂交方法及杂交胚培养

2.2.4杂交胚离体培养发育苗(F1)愈伤组织的诱导

2.2.5过氧化物同工酶分析

3结果分析

3.1高加索三叶草与白三叶草的核型分析

3.1.1高加索三叶草核型分析

3.1.2白三叶草核型分析

3.2高加索三叶草与白三叶草再生体系的研究

3.2.1不同培养基对不同外植体愈伤组织诱导率的影响

3.2.2不同培养基对愈伤组织继代培养的影响

3.2.3激素组合对高加索三叶草愈伤组织分化的影响

3.3高加索三叶草与白三叶草杂交胚萌发和杂交胚离体培养的初步研究

3.3.1花粉生活办和亲本组合的确定

3.3.2花粉贮藏后活力变化

3.3.3杂交胚离体培养消毒时间的确定

3.3.4杂交胚授粉时间的确定

3.3.5不同发育时期杂交胚离体培养的萌发条件

3.3.6杂交胚离体培养成苗过程

3.3.7杂交胚离体培养萌发过程中的不同激素配比

3.4杂交后代愈伤组织诱导

3.4.1激素组合对茎段愈伤组织诱导的影响

3.4.2不同外植体诱导培养基的筛选

3.5同工酶分析

3.5.1亲本及杂交胚离体培养产生的后代茎段愈伤组织POD酶谱分析

3.5.2激素对杂交胚离体培养产生的后代茎段愈伤组织POD同工酶的影响

3.5.3杂交后代不同外植体愈伤组织POD同工酶谱分析

3.5.4遗传相似性

4讨论

5结论

致谢

参考文献

附图

作者简介