农杆菌转化Bt和抗菌肽融合基因获得转基因油菜的研究

摘要

油菜在中国国民经济中占有举足轻重的地位，是中国最重要的油料作物之一，同时也是中国最主要的经济作物之一。油菜在中国有着十分广泛的种植区域，但它极易遭受到各种病虫害的侵害，其中白斑病和黑斑病都属于真菌引起的病害。本研究采取抗菌肽与Bt相融合的基因构建植物表达载体并用农杆菌介导的方法转入油菜，以草甘膦为筛选标记获得抗真菌和鳞翅目害虫的转基因油菜作物。 1.PCAMBA1300的改造，利用XholⅠ酶切位点去除潮霉素抗性标记基因，获得13P质粒。 2.利用BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，将抗除草剂基因EPSPS转入13P，获得有抗除草剂功能的13P—EPSPS质粒。 3.利用BamHⅠ、HindⅢ和DraⅢ等酶切位点及平端连接技术将抗虫抗病融合基因转入13P—EPSPS质粒，获得抗虫、抗病、抗除草剂的13P—EPSPS—Bt—AMP质粒。 4.将油菜种子接入固体MS。培养基，无菌培养5天，取其子叶柄做为受体材料，进行农杆菌的侵染。 5.将侵染过的油菜子叶柄转入含有0.5mg/l草甘膦和200mg/l羧苄青霉素的MB分化筛选培养基中。 6.将筛选的绿芽接种到附加有0.2mg/l草甘膦和100mg/l羧苄青霉素的RN生根培养基上，当根长长至2cm以上时即可移植到土壤中。 7.进行目的基因的PCR检测，确定已获得所要的抗性转基因苗。 研究中共用油菜子叶柄300个，分化再生芽38个，筛选获得转基因植株7棵，转化率为2.33％。

目录

文摘

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声明

1引言

1.1 油菜的主要病虫害

1.2抗菌肽基因的研究及其应用

1.2.1抗菌肽的发现

1.2.2抗菌肽的分类

1.2.3抗菌肽的作用机理

1.2.4抗菌肽的研究与应用

1.3苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白基因

1.4 Bt抗虫植物的研究进展

1.5抗除草剂的基因EPSPS

1.6中国转基因油菜的研究

1.6.1抗性转基因油菜的研究进展

1.6.2转基因油菜的受体材料

1.6.3转基因油菜的转化方法

1.7本研究的目的和意义

1.8技术路线

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和质粒

2.1.3酶与试剂

2.1.4引物设计

2.1.5培养基

2.1.6溶液配制

2.1.7仪器设备

2.2试验方法

2.2.1真核表达载体PCAMBA1300、中间载体SPnE和植物表达载体pBI121质粒的提取

2.2.2构建含草甘膦抗性的表达载体

2.2.3构建含草甘膦抗性同时含有目的抗虫抗病基因的的表达载体

2.2.4根癌农杆菌转化13P-EPSPS-Bt-AMP获得转基因油菜

3结果与分析

3.1构建含草甘膦抗性同时含有抗虫抗病基因的的表达载体13P-EPSPS

3.1.1 PCAMBA1300的改造

3.1.2含草甘膦抗性表达载体的构建

3.1.3 构建含草甘膦抗性同时含有目的抗虫病毒基因的表达载体

3.2油菜无菌苗的农杆菌转化

3.3转基因油菜的鉴定

4讨论

4.1 Bt杀虫蛋白基因的改造

4.2融合基因的功能鉴定

4.3除草剂草甘膦选择浓度的确定

4.4羧苄青霉素选择浓度的确定

5 结论

致 谢

参考文献

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