甜菜抗丛根病细胞生物学特征研究—着重于活性氧代谢及细胞壁成分的研究

摘要

甜菜是我国乃至世界上重要的糖料作物和经济作物之一，由于长期以来受到甜菜各种病害的袭击，不仅给甜菜生产造成巨大的经济损失，并且制约制糖业的发展。甜菜丛根病(Rhizomania)是危害最为严重的病害之一，该病以多粘菌（Polymyxa betae）为传播介体，由甜菜坏死黄脉病毒（Beet necroticyellow vein virus，BNYVV）引起的土传病害。近年来，国内外主要从病原基因组学、分子生物学及寄主生理生化角度来探讨病毒致病机理和甜菜抗丛根病机理。本研究以甜菜抗、感丛根病品种与 BNYVV互作体系为研究对象，对不同互作体系中的形态学特征和细胞学特征进行了比较研究，利用生理生化方法明确不同互作体系间活性氧（H2O2和O2-·）及保护酶系（POD和SOD）产生的时间变化特征，采用电镜细胞化学标记技术在亚细胞水平上对活性氧（H2O2和O2-·）及保护酶系（POD和SOD）的空间分布进行了定位，并检测了不同互作体系间木质素组织定位的差异及细胞壁糖蛋白在寄主细胞内积累的规律，以明确活性氧代谢及细胞壁成分在甜菜抗丛根病性中的作用，从而为进一步揭示甜菜抗丛根病信号传导机制奠定理论基础。通过研究取得的主要结果如下：
　　1.利用光学显微技术和透射电镜技术研究了甜菜抗、感丛根病品种与 BNYVV互作过程中的形态学和超微结构特征。结果表明，不同寄主与病毒互作体系的甜菜块根形态学和超微结构上均表现出明显的差异，而甜菜叶脉受该病毒侵染后其形态学解剖结构无差异，但超微结构受到影响。形态学水平上，抗、感病品种表现为表皮破坏，皮层薄壁细胞组织产生裂隙，大多细胞都脱落，木质部附近的木薄壁细胞破损，完全丧失了对根部的保护作用。其中感病品种比抗病品种表现被伤害程度更为严重，其皮层薄壁细胞几乎全部脱落，生长速度缓慢，根部发育受阻。而叶脉的形态解剖结构与对照比较，未发现异常变化。另外抗病品种比感病品种有更发达的维管束结构。在亚细胞水平上，BNYVV对感病品种的细胞超微结构破坏严重，整个细胞变形，空虚化，细胞核结构发生紊乱，线粒体和高尔基体明显增多，细胞质中小液泡增多，在液泡膜边缘可见到一些纤细丝状物质的圆形或卵圆形小泡突入液泡中。叶脉细胞叶绿体完全瓦解，出现许多嗜锇颗粒。而抗病品种细胞超微结构破坏较轻，寄主细胞产生一系列显著的结构防卫反应：形成细胞壁沉积物及液泡膜上显示出黑色颗粒状沉积物等。说明组织形态结构变化和细胞器病理变化与甜菜抗丛根病性有关。
　　2.利用生理生化方法和电镜细胞化学标记技术研究了甜菜－BNYVV互作过程中 H2O2和O2-·产生的时间变化特征和空间分布定位。研究结果表明，甜菜抗、感丛根病体系均在侵染早期出现大量 H2O2和O2-·，其中抗病体系的H2O2和O2-·产生量明显高于感病体系。H2O2在抗病和感病体系中的分布位置基本相似，多分布在块根、叶脉细胞的液泡膜和质膜上，叶脉细胞间隙也有H2O2的分布，而 O2-·在抗病品种块根与叶脉细胞的质膜上定位，感病品种的则在液泡膜上被发现。而且感病体系 H2O2和O2-·沉积量明显弱于抗病体系。H2O2和O2-·产生量和分布与甜菜抗丛根病性有密切联系，不同部位定位的H2O2和O2-·作为信号分子，参与了甜菜对病毒侵染的防御反应。
　　3.采用生化检测及酶细胞化学方法研究了甜菜与 BNYVV互作过程中 POD和SOD的活性及其在细胞内分布特征。结果表明，病毒感染前 POD主要定位在甜菜块根细胞细胞壁及叶脉细胞线粒体和细胞间隙，当病毒感染后，抗、感病甜菜品种块根皮层细胞的细胞壁、质膜和液泡膜上的POD及叶脉薄壁细胞的细胞壁、质膜、液泡膜、线粒体、细胞间隙上的POD活性均比其对照显著升高，抗、感病甜菜品种在 POD分布部位上没有区别，但两者沉积量有所差异，抗病品种明显高于感病品种；SOD在未感染病毒的抗、感病甜菜块根皮层薄壁细胞质膜与液泡膜，叶脉厚角组织薄壁细胞质膜及叶脉细胞线粒体、细胞间隙上被发现，病毒侵染后甜菜抗、感病品种块根 SOD在细胞内分布位置相同都分布在质膜和液泡膜，但抗病品种以质膜上分布为主，感病品种以液泡膜上分布为主。抗病品种 SOD活性不仅明显高于其对照，也明显高于病毒侵染后的感病品种。甜菜抗、感病品种 POD及 SOD细胞内分布的沉积量与生理生化检测的酶活性结果一致，从亚细胞学水平说明高活性的POD及 SOD是甜菜抗丛根病性生化标记的重要生理机制之一。
　　4.通过组织化学染色法及电镜细胞化学方法研究 BNYVV对甜菜细胞壁中木质素和HRGP的影响。结果显示，BNYVV侵染前后在甜菜抗、感病品种的块根与叶脉横切面的所有导管上均有木质素和HRGP的沉积，块根薄壁组织的细胞壁由外向内也逐渐显示出由深至浅的木质素沉积；抗病品种木质素和HRGP的积累量较感病品种和其对照增加更为显著；说明在甜菜与 BNYVV互作体系中，HRGP参与木质素的合成，木质素和HRGP在甜菜组织内快速积累是甜菜抗丛根病性的表现之一。

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1 引言

1.1 甜菜丛根病的研究概况

1.2 植物抗病机制概述

1.3 植物组织化学和细胞化学研究概述

1.4 研究的目的和意义

2 BNYVV 侵染甜菜后最适取样时期的确定

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 小结

3 甜菜－甜菜坏死黄脉病毒互作中形态学及超微结构研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

4 甜菜—甜菜坏死黄脉病毒互作过程中活性氧（H2O2和 O2-·）的积累与分布

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

5 甜菜与甜菜坏死黄脉病毒互作中保护酶系（POD 和 SOD）活性及其细胞化学定位

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

6 甜菜坏死黄脉病毒胁迫下甜菜细胞壁木质素和糖蛋白的组织细胞化学研究

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论

6.4 小结

7 结论

致谢

参考文献

作 者 简 介