金黄色葡萄球菌血清8型荚膜多糖的提取纯化及其偶联物免疫学特性的研究

摘要

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎（cow mastitis）的主要病原菌之一，而荚膜多糖和黏附素是金黄色葡萄球菌最主要的毒力因子。当金黄色葡萄球菌侵入机体后，由于荚膜多糖的抗吞噬作用，使其难以被吞噬细胞吞噬清除，进而细菌的黏附素识别并特异性的黏附到组织、细胞的特定分子上是感染的关键，细菌成功定植后，进一步产生酶和毒素，使得感染难以控制。因此本文通过化学方法将荚膜多糖和黏附素蛋白偶联，制备偶联物，并对其进行免疫学特性的研究。从而为构建金黄色葡萄球菌荚膜多糖-黏附素蛋白二价毒力因子疫苗奠定了理论和实验基础。
　　本实验研究在哥伦比亚固体培养基中添加不同的营养成分，通过观察菌落生长情况，从而对金黄色葡萄球菌的培养条件进行优化。用此条件培养的金黄色葡萄球菌菌株，采用加酶法对血清8型荚膜多糖进行提取，并用酚提蛋白法和过柱层析法对提取的粗糖进行纯化，同时用苯酚-硫酸法测定多糖含量。在获得纯化的血清8型荚膜多糖的基础之上，以己二酰肼为间桥，碳二亚胺为偶联剂，纯化的ClfA-FnBPB融合蛋白为载体蛋白，使CP和ClfA-FnBPB偶联制备偶联物。在偶联过程中确定荚膜多糖-蛋白质偶联物的最佳质量比。其次，利用紫外光谱扫描法、苯酚-硫酸法等对偶联物进行定性和定量分析并计算偶联比。最后，用制备的偶联物免疫 BalB/c小鼠，同时用间接 ELISA法检测抗体水平，并对小鼠进行攻毒保护试验，评价免疫效果。
　　结果显示，产生血清8型荚膜多糖的金黄色葡萄球菌在加有1％乳糖、2％NaCl和10％胎牛血清的哥伦比亚固体培养基上生长最旺盛。用此条件培养的菌株提纯的荚膜多糖，其粗糖的纯度为34.43﹪，精制多糖的纯度为79.68﹪。核酸和蛋白的含量为0.1365mg/mL。用化学方法制备的荚膜多糖-蛋白质偶联物在其质量比为1:2时可证明偶联成功，计算得到偶联比为1：1.89。采用间接ELISA法检测抗体水平，二免后7天，偶联物组可产生抗体，且抗体效价最高可达1:6400，说明偶联物刺激小鼠产生了免疫应答。阴性对照组和单独多糖组均没有抗体产生，而单独融合蛋白组在二免后产生了抗体反应，但抗体效价较低，最高时仅为1:100。本实验对三免后两周的小鼠进行攻毒保护，结果表明，偶联物组的攻毒保护率最高，可达80﹪，而阴性对照组、单独多糖组以及单独融合蛋白组的保护率分别为20﹪、30﹪和60﹪，可见荚膜多糖-蛋白质偶联物有较好的免疫原性，达到了本实验的预期目标。

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1 引言

1.1 奶牛乳房炎的分类

1.2 金黄色葡萄球菌的研究

1.3 金黄色葡萄球菌CP研究进展

1.4 金黄色葡萄球菌的黏附素

1.5 金黄色葡萄球菌CP的提取和纯化

1.6 金黄色葡萄球菌CP偶联物的制备

1.7 结论与展望

2 金黄色葡萄球菌血清8型CP的提取和纯化

2.1 金黄色葡萄球菌培养条件的优化

2.2 金黄色葡萄球菌血清8型荚膜多糖的粗提

2.3 荚膜多糖粗提物含糖量测定

2.4 金黄色葡萄球菌血清8型CP的纯化

3 融合蛋白的诱导表达

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 结论

4 血清8型荚膜多糖偶联物的制备及免疫学特性的研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 结论

5 总体讨论

5.1 不同培养基对荚膜多糖粗提量的影响

5.2 荚膜多糖粗提方法的比较

5.3 荚膜多糖纯化方法的比较

5.4 影响荚膜多糖过柱纯化的因素

5.5 多糖-蛋白偶联物的制备

6 总体结论

致谢

参考文献

作 者 简 介