荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞β-防御素mRNA的表达及可能信号通路的初步研究

摘要

防御素是一种富含精氨酸的阳离子低分子短肽，对G+、G-菌，真菌、包膜病毒和螺旋体等都有广谱的杀伤作用。它不仅是新型高效的抗菌多肽，能直接杀菌，抵御入侵机体的病原微生物，而且能调节机体免疫应答、调节组织创伤修复、在介导获得性免疫反应过程中起着重要作用。防御素是动物机体内防御系统中重要的成员，提示防御素可能在奶牛乳腺中抵抗微生物感染、维持乳腺健康方面起着至关重要的作用。在奶牛发生乳腺炎时，防御素应参与了乳腺的防御过程，但防御素产生了怎样的变化，在变化的过程中又是如何调控的仍不清楚。
　　目前防御素在抗乳腺炎和其防御机制方面的研究报道非常少，而关于β-防御素抗乳腺炎的作用过程更是少之又少，也未见其在奶牛乳腺中的表达调控机制方面的研究。为此我们初步研究了β-防御素基因在奶牛乳腺的表达情况和LPS诱导时β-防御素基因的表达变化及其可能调控的信号通路。其结果如下：
　　1、克隆了奶牛乳腺组织EBD、TAP、LAP、BNBD4、BNBD5和BNBD7基因。以奶牛乳腺组织为材料，提取乳腺组织总RNA，根据NCBI数据库中牛β-防御素cDNA的保守序列分别设计特异性引物，采用RT-PCR技术扩增基因片段，纯化后连接pMD19-T载体，转化入大肠杆菌后挑取阳性重组质粒测序，测序结果证实 EBD、TAP、LAP、BNBD4、BNBD5和BNBD7在奶牛乳腺组织有表达。
　　2、建立稳定的奶牛乳腺上皮细胞培养体系，并确定乳腺上皮细胞6种β-防御素基因的表达情况。采用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法对奶牛乳腺上皮细胞进行分离、培养和纯化。对奶牛乳腺上皮细胞进行原代培养以及传1代细胞的传代培养。经形态学、核型分析和运用RT-PCR方法检测α-酪蛋白基因的表达，绘制生长曲线等方法对所培养的奶牛乳腺上皮细胞进行鉴定和分析，结果证实所培养的细胞为上皮细胞，细胞生长状态良好，符合细胞生长规律。在成功培养奶牛乳腺上皮细胞的基础上，提取乳腺上皮细胞总RNA，运用RT-PCR方法扩增6种β-防御素（EBD、BNBD4、BNBD5、BNBD7、LAP、TAP），测序结果证明6种β-防御素基因在奶牛乳腺上皮细胞有表达。
　　3、获得奶牛乳腺组织与乳腺上皮细胞6种β-防御素mRNA的基础表达水平。通过RT-qPCR方法对6种β-防御素进行扩增及数据统计分析。结果表明，乳腺组织中6种β-防御素基因的相对表达量有显著性差异（P<0.01），仅BNBD4与BNBD5之间的相对表达量没有显著性差异，其中LAP相对表达量最多，BNBD7、EBD、BNBD5、BNBD4次之，TAP的相对表达量最低。奶牛乳腺上皮细胞中6种β-防御素基因mRNA水平的相对表达量有显著性差异（P<0.01），仅EBD与BNBD4之间的相对表达量没有显著性差异，其中LAP相对表达量最多，BNBD7、BNBD5、BNBD4、EBD次之，TAP的相对表达量最低。
　　4、为了研究乳腺上皮细胞中6种β-防御素mRNA表达水平，我们培养乳腺上皮细胞，添加代表大肠杆菌为主要侵染力的脂多糖（LPS）建立试验性乳腺炎的乳腺上皮细胞模型。首先，确定了最佳的传1代细胞来研究6种β-防御素的表达变化。然后在奶牛乳腺上皮细胞中添加不同剂量（50、100、200、400、800 ng/ml）LPS处理不同时间（2、4、8、16、24、48、72h），采用实时RT-qPCR方法检测乳腺上皮细胞中6种β-防御素mRNA的表达水平。结果表明：①乳腺上皮细胞中6种β-防御素mRNA表达量与空白对照组相比存在一定的剂量和时间效应，有些随着浓度增加而表达量增高，如LAP，这可能与其基础表达量有关；在时间上总体趋势是当LPS诱导后主要在8h、48h与72h时相对表达量达到高值，在2h、4h、16h和24h表达量相对较低，推测与其信号通路基因的调控时间相关。②LAP表达量差异较大，增加幅度较高，在奶牛乳腺防御中起重要的防御作用。③乳腺上皮细胞中6种β-防御素mRNA的表达量都显著增加，表明6种β-防御素的表达都呈诱导型表达。
　　5、确定奶牛乳腺上皮细胞中是否有TLR2、TLR4、NF-κB P65、CREB表达，根据已发表的基因各自序列设计特异性引物，经RT-PCR鉴定及测序证明4种基因在奶牛乳腺上皮细胞可表达。然后采用RT-qPCR技术检测4个基因mRNA的表达变化。结果表明：①LPS刺激后TLRs中TLR2与TLR4的介导作用中，TLR2主要在4h时起介导作用，在2h、8h和48h起部分调控作用；TLR4在除4h外的几个时间段起主要的介导作用。②TLR2与TLR4都介导了LPS刺激时的调控过程，在整个调控过程中以TLR4起主要介导作用。③CREB在与NF-κB并行的信号通路中，CREB和核因子NF-κB都参与了炎症的调控过程。④在调控过程中CREB主要在8h时起调节作用，NF-κB在各时段都有显著性差异，调控增幅较大。⑤脂多糖对于4种调控因子的表达量都有促进作用。
　　6、为了进一步确定NF-κB途径是否为脂多糖诱导防御素表达的信号通路之一，我们在传1代乳腺上皮细胞添加特异性抑制剂PDTC以阻断NF-κB信号通路，然后采用RT-qPCR技术检测BNBD5、BNBD7、TAP、LAP、EBD和BNBD4等基因mRNA表达水平。结果表明：BNBD5、BNBD7、TAP、LAP、EBD和BNBD4 mRNA表达量均有下降，在荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞中NF-κB为LPS诱导β-防御素基因表达的信号通路之一。

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1 引言

1.1 奶牛乳腺炎及防治的研究进展

1.2 防御素的研究进展

1.3 本研究的目的意义

2 试验一 荷斯坦奶牛乳腺组织β-防御素基因cDNA的克隆与序列分析

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

3 试验二 荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞培养与其内β-防御素的克隆

3.1 材料与试剂

3.2 试验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

4 试验三 荷斯坦奶牛乳腺组织与上皮细胞β-防御素的差异表达

4.1 材料与方法

4.2 试验方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

5 试验四 荷斯坦奶牛乳腺细胞添加LPS后β-防御素的表达变化

5.1 材料与方法

5.2 试验方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 小结

6 试验五 乳腺上皮细胞通过LPS刺激后可能通路的表达变化研究

6.1 试验材料与试剂

6.2 试验方法

6.3 结果

6.4 讨论

6.5 小结

7 试验六 阻断NF-κB对乳腺上皮细胞防御素表达的影响

7.1 试验材料与试剂

7.2 试验方法

7.3 结果

7.4 讨论

7.5 小结

8 结论

致谢

参考文献

附录

作 者 简 介