荷斯坦奶牛乳腺来源干细胞的初步分离及鉴定

摘要

荷斯坦奶牛(Holstein)是全世界乳牛的主要品种之一，也是目前生产每单位牛乳所需饲料费最低的品种。乳腺干细胞与产奶量具有密切联系，同时也是研究生物反应器的重要材料。
　　为得到荷斯坦奶牛乳腺来源干细胞，本研究通过使用400 UI/mL胶原酶、37℃环境下消化20h，得到乳腺细胞，再经悬滴培养法筛选纯化，后续贴壁培养，获得奶牛乳腺来源干细胞干细胞具有以下特性。
　　1.具有分化成其它类型细胞的能力，经诱导培养，该细胞分化为成骨细胞，茜素红染色显红色钙化骨结节。
　　2.自我增殖能力:在悬滴培养条件下能够形成类似乳腺球结构细胞团。表达了干细胞标记基因Nanog、Sox2、Oct4，以及乳腺干细胞参考标记基因CD24、CD29、CD49。
　　本研究得到的荷斯坦牛乳腺来源干细胞经液氮冻存后复苏仍具有较好的细胞活性;经染色体数目分析，该细胞染色体为正常二倍体，表明在细胞具有较好的遗传稳定性。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 乳腺的发育

1．2 奶牛乳腺的结构特点

1．3 乳腺干细胞特性

1．3．1 乳腺干细胞的发现

1．3．2 乳腺干细胞标记研究

1．3．3 乳腺干细胞的定位

1．3．4 乳腺干细胞的增殖特性

1．3．5 乳腺干细胞的分类

1．4 乳腺干细胞分离培养

1．4．1 流式细胞仪分离

1．4．2 免疫磁珠法

1．4．3 悬浮培养法

1．5 乳腺干细胞发育微环境及相关信号通路

1．5．1 乳腺干细胞微环境

1．5．2 乳腺干细胞相关信号通路

1．6 悬滴培养

1．7 乳腺干细胞的研究意义及存在的问题

1．7．1 乳腺干细胞的研究意义

1．7．2 乳腺干细胞研究中存在的问题

1．8 本研究的目的

2 乳腺来源干细胞盼原代分离

2．1 实验材料

2．2 主要实验试剂

2．3 实验仪器及基本耗材

2．4 实验方法

2．5 实验结果

3 乳腺来源干细胞的纯化

3．1 实验材料

3．2 主要实验试剂

3．3 主要实验仪器及耗材

3．4 实验方法

3．5 结果分析

4 乳腺来源干细胞的扩增培养

4．1 实验材料

4．2 主要实验试剂

4．3 主要实验仪器及耗材

4．4 实验方法

4．4．1 乳腺来源干细胞的连续传代

4．4．2 乳腺来源干细胞生长曲线的绘制

4．4．3 乳腺来源干细胞的冻存与复苏

4．4．4 乳腺来源干细胞的染色体数分析

4．5 实验结果

4．5．1 乳腺来源干细胞的连续传代

4．5．2 乳腺来源干细胞生长曲线的绘制

4．5．3 乳腺来源干细胞的冻存与复苏

4．5．4 乳腺来源干细胞的核型分析

5 乳腺来源干细胞的初步鉴定

5．1 实验材料

5．2 主要实验试剂

5．3 主要实验仪器及耗材

5．4 实验方法

5．4．1 乳腺来源干细胞乳腺球再形成实验

5．4．2 乳腺来源干细胞成骨定向诱导分化

5．4．3 乳腺来源干细胞诱导形成肌上皮细胞

5．4．4 乳腺来源干细胞的分子鉴定

5．5 结果分析

5．5．1 乳腺来源干细胞乳腺球的再形成

5．5．2 乳腺来源干细胞成骨诱导分化

5．5．3 乳腺来源干细胞诱导形成肌上皮细胞

5．5．4 乳腺来源干细胞的分子鉴定

6 讨论

6．1 乳腺来源干细胞的原代分离

6．2 乳腺来源干细胞的纯化

6．3 乳腺来源干细胞的初步鉴定

7 全文结论

致谢

参考文献

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