向日葵NBS型抗锈病相关基因的克隆与分析

摘要

向日葵是一种重要的油料作物，但在生产上经常会受到多种病原菌的侵害，其中向日葵锈菌(Puccinia helian(r)hi Schw.)就是向日葵的主要病害之一，严重影响着向日葵的产量和含油量。为了找到向日葵抗锈病相关基因，本研究运用同源序列克隆法，克隆获得了向日葵抗病基因同源序列(HaRGA)，并对其进行分析。主要研究结果如下:
　　1.根据已知NBS-LRR型抗病基因的保守结构域P-loop和GLPL设计筒并引物，以接菌的抗病向日葵品种CM29叶片的cDNA为模板进行扩增，分离克隆得到10个具有连续开放阅读框的RGA。对其进行系统进化分析，这些HaRGA分属于TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR两种类型。对其氨基酸序列进行多重序列比对，结果显示所获得的HaRGA具有典型的NBS-LRR型抗病基因的保守结构域即P-loop、kinase-2a、kinase-3a和GLPL等结构域。同源性分析结果表明，HaRGA与已知的NBS-LRR型抗病基因的同源性为18.1％～51.1％。根据以上结果推测它们可能与抗病功能基因具有密切联系，已将这10个HaRGA提交到GenBank，登录号为KJ620870～KJ620879。
　　2.运用荧光定量PCR技术，分析在向日葵锈菌侵染和不同激素（SA、ETH和H2O2）处理条件下HaRGA的表达情况。结果表明HaRGA1和HaRGA4在接种了向日葵锈菌后的抗病植株叶片内表达量均呈现明显上调，而在未接种锈菌的对照叶片中HaRGA1和HaRGA4的表达量变化并不明显。在经过激素处理后，HaRGA1和HaRGA4两个基因的表达量都有明显的变化，其中HaRGA1基因在受双氧水处理后表达量很快就明显上升，并持续大量表达;HaRGA4基因对于水杨酸和乙烯处理的响应更加明显，尤其是在水杨酸处理后该基因持续的显著上调表达，上述结果也显示出得到的这两个HaRGA基因对不同激素有着显著响应。以上结果说明HaRGA1和HaRGA4可能参与了向日葵对锈菌的抗病反应,而且在不同的抗病途径中起着重要作用，这些结果将为向日葵抗锈病基因的研究提供理论基础。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 向日葵锈病的研究进展

1．1．1 向日葵锈病的危害

1．1．2 向日葵锈病的防治

1．1．3 向日葵抗锈病育种的研究进展

1．2 植物的抗病机制及抗病基因的研究

1．2．1 植物抗病机制

1．2．2 植物抗病基因的类型

1．2．3 植物抗病基因的结构与功能

1．2．4 植物抗病基因的克隆方法

1．3 RGA的表达分析

1．4 本研究的目的意义

2 向日葵NBS型RGAs的克隆研究

2．1 材料与方法

2．1．1．材料

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器

2．1．4 培养与接菌方法

2．1．5 样品采集

2．1．6 向日葵叶片总RNA的提取

2．1．7 RNA的纯化及检测

2．1．8 cDNA第一链的合成

2．1．9 引物的设计及合成

2．1．10 PCR扩增

2．1．11 PCR扩增产物回收

2．1．12 回收产物连接

2．1．13 感受态细胞的制备

2．1．14 连接产物转化

2．1．15 阳性克隆PCR检测

2．1．16 质粒提取

2．1．17 PCR产物测序及序列分析

2．2 结果与分析

2．2．1 向日葵总RNA提取

2．2．2 PCR扩增

2．2．3 片段回收、克隆及阳性克隆鉴定

2．2．4 质粒提取与测序

2．2．5 阳性克隆的测序结果初步分析

2．2．6 向日葵HaRGA系统进化树分析

2．2．7 向日葵HaRGAs氨基酸序列相似性分析

2．2．8 向日葵HaRGAs氨基酸多重序列对比

2．3 讨论

3 向日葵RGA的表达谱分析

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 材料的种植培养、处理及采样

3．1．3 试剂

3．1．4 仪器

3．1．5 RNA提取

3．1．6 RNA的纯化及检测

3．1．7 cDNA第一链的合成

3．1．8 引物设计、合成及检测

3．1．9 RT-PCR反应

3．2 结果与分析

3．2．1 向日葵总RNA提取

3．2．2 定量引物检测

3．2．3 表达谱分析

3．3 讨论

4 全文结论

致谢

参考文献

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