中间锦鸡儿响应脱水胁迫的转录组学研究及部分次生代谢相关基因的表达分析

摘要

中间锦鸡儿（Caragana intermedia Kuang et H.C.Fu)又名柠条，属于豆科锦鸡儿属多年生灌木，是干旱草原、荒漠草原地带的优良固沙和水土保持植物，具有很高的生态价值和经济价值，其超强的耐旱能力使其可作为研究植物耐旱机理、获得优异耐旱基因的理想材料。当前，有关中间锦鸡儿的遗传信息非常匮乏，对其抗旱分子机理的研究进展相对滞后。鉴于此，本研究综合利用二代测序技术Illumina平台对脱水处理的中间锦鸡儿幼苗进行转录组深度测序，得到了大量的表达基因信息，分析了其响应脱水胁迫的转录组水平变化，获得了耐旱相关差异表达基因及代谢通路；此外，对转录组数据中的SSR(Simple Sequence Repeat)位点进行了识别和初步验证；对其次生代产物黄酮类合成相关基因的表达模式进行了分析，并初步检测了茎叶中芦丁的含量。本研究取得的主要结果如下：
　　1、经de novo组装，对照以及干旱处理1h、3h和12h的Clean Reads分别组装拼接成32,560,395、33,669,219、24,681,821和23,805,919条Unigenes；上述序列进一步拼接和去冗余最终得到362633条All-Unigenes；其中比对到COG库的64,750条Unigenes被注释到25个COG基因簇中；有200,422能比对Nr库(蛋白质库)，占全部Unigenes的55.27％，这些Unigenes中有130,951条GO注释到9,104个GO Term；GO注释基因的生理过程主要集中于氧化反应、跨膜运输、代谢合成、转录调控以及氨基酸水解反应，基因的细胞组分主要集中于细胞核、叶绿体基质、胞间连丝等部位，生理功能主要集中于水解、RNA结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等几大类。
　　2、对269,857条Unigenes cluster进行表达量分析，在此基础上对4个样品进行差异表达分析。上调表达基因数量多于下调表达基因数量，差异表达基因随脱水处理时间延长而增多。1h与0h样品间有856条上调DEGs和439条下调DEGs分别分布在109个和66个GO条目中，其中蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶基因在干旱处理1h样本中富集，受体类似蛋白激酶、酶联受体蛋白信号通路也在下调表达基因中富集，暗示蛋白激酶可能与中间锦鸡儿干旱胁迫早期应答中信号的转导过程相关；3h与1h样品间有538上调DEGs和341条下调DEGs分别分布在82个和46个GO条目中；12h与3h样品间有1,299条上调DEGs和1,902条下调DEGs分别分布在15个和21个GO条目中，其中脱落酸刺激应答相关通路参与了干旱胁迫晚期应答；共差异基因中上调表达766条，下调表达505条，其中367个上调Co-DEGs被注释到57个GO条目中，160个下调Co-DEGs被注释到20个GO条目中。部分Unigenes的qRT-PCR检测结果证明转录组中基因表达量的结果是可靠的。
　　3、在362,633条Unigenes中检测到305种、共45,706个SSR，出现频率为10.38%；SSR位点平均长度为115.37bp。对随机挑选的150对SSR引物进行了验证，其中的79对引物有PCR扩增条带。
　　4、qRT-PCR验证了与次生代谢相关的部分差异表达基因；设计正交实验用超声波辅助提取测定黄酮类物质的含量，其中芦丁最佳提取条件为：提取时间60min、提取温度60℃、乙醇浓度80%和液料比1:10。利用HPLC检测发现叶片中芦丁含量高于茎部，生长后期组织中芦丁含量高于生长早期，二者差异达到显著水平。随着干旱处理时间的延长，中间锦鸡儿芦丁含量呈上升趋势。

目录

缩 略 语 表

1 引言

1.1 植物抗旱机理及研究进展

1.2 转录组学研究概况

1.3 SSR、EST-SSR及其研究进展

1.4 中间锦鸡儿研究进展

1.5 本课题选题背景及研究意义

1.6 研究内容和主要技术路线

2 中间锦鸡儿RNA样本制备及转录组测序

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

3 转录测序(RNA-seq)基础分析及转录数据组装

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

4 转录组差异表达基因（DEG）和共差异表达基因（co_DEG）分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

5 基于转录组信息的中间锦鸡儿SSR分子标记的鉴定与初步验证

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 SSR位点的PCR扩増结果

5.5 讨论

5.6 小结

6 中间锦鸡儿次生代谢相关差异表达基因及黄酮类物质含量的测定

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

6.4 讨论

6.5 小结

7 结论

8 展望

致谢

作 者 简 介