Sox2基因对绵羊体细胞克隆不同供体细胞表观遗传修饰的影响

摘要

哺乳动物体细胞克隆技术自诞生以来，发展迅速且日益趋于成熟，但体细胞克隆效率低始终是制约其在畜牧业生产中应用与发展的瓶颈。核不完全重编程及供体细胞的类型与克隆效率密切相关。表观遗传修饰中DNA甲基化、组蛋白乙酰化是影响核重编程的关键因素。研究证实，sox2基因对维持细胞多能性及胚胎着床后的发育起关键的作用，以高表达 sox2基因的神经干细胞为核供体进行核移植时具有较高的克隆效率。
　　为此，本研究以内蒙古地区优势畜种绵羊为实验对象，选择绵羊骨髓间充质干细胞（Bone Marrow-derivedMesenchymal Stem Cells, BMSCs）、脂肪间充质干细胞（Adipose-derived Stromal Cells,ADSCs）和皮肤成纤维细胞（Sheep Epidermal Fibroblast Cells,SEFCs）为核供体，经电转染将sox2基因导入BMSCs和ADSCs和SEFCs，检测sox2基因对三类核供体细胞DNA甲基转移酶1（DNA Methyltransferase1,DNMT1）和组蛋白去乙酰化酶2（Histone Deacetylase2,HDAC2）基因的表达水平，分析了 sox2基因对三类核供体细胞表观遗传修饰的影响。同时以导入 sox2基因的BMSCs为核供体构建重构胚，以SEFCs核供体构建的重构胚为对照，分析了sox2基因对重构胚表观遗传修饰及发育能力的影响。主要研究结果如下：
　　（1）分离得到了绵羊BMSCs、ADSCs和SEFCs细胞系，三类细胞生长曲线均呈“S”型；经RT-PCR检测，BMSCs和ADSCs均表达了干细胞特异因子Sox2、Oct4和Nanog基因。
　　（2）构建了pEGFPS-N1-Sox2真核表达载体，对BMSCs、ADSCs和SEFCs三类细胞进行了电转染，经筛选得到过表达sox2基因细胞株，经实时定量PCR检测，三种过表达sox2基因细胞株中的DNMT1和HDAC2基因表达量表现出不同程度的下降，DNMT1分别下降多少68％、25%、43%；HDAC2下降了15%左右。
　　（3）以过表达sox2基因BMSCs为核供体，构建重构胚159个，以SEFCs为核供体构建重构胚182个。检测两类重构胚中DNMT1和HDAC2的表达量，过表达sox2基因BMSCs为供体的克隆胚比以SEFCs构建的克隆胚中DNMT1和HDAC2的表达量低50%左右，由此推测 sox2基因的过表达可能有利于克隆胚核的重编程，进而促进重构胚的发育。
　　以上结果对阐明 sox2基因影响不同核供体细胞表观遗传修饰的机制奠定了必要的基础，为通过选择及对不同核供体细胞进行遗传修饰从而提高体细胞克隆效率提供了新的方法，进而为日后利用转基因体细胞克隆技术进行优质绵羊种畜的改良及高效快繁提供了科学依据。

目录

声明

缩 略 语 表

1引言

1.1 体细胞克隆的研究进展

1.2体细胞克隆中供体细胞的类型

1.3 不同类型供体细胞对体细胞克隆的影响

1.4表观遗传对体细胞克隆的影响

1.5其他因素对体细胞克隆的影响

1.6体细胞克隆的应用及存在问题

1.7 Sox2基因的研究

1.8本研究的目的和主要研究内容

2 实验一 绵羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）、脂肪间充质干细胞（ADSCs）、和皮肤成纤维细胞（SEFCs）系的建立

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果分析

2.4 讨论

2.5 小结

3 实验二 Sox2基因转染 ADSCs、BMSCs和SEFCs及其表观遗传分析

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

5 结论

致谢

参考文献

附录

作 者 简 介