转过表达和低表达胰岛素样生长因子Ⅰ基因牛成纤维细胞系的制备

摘要

胰岛素样生长因子I(IGF-I)在哺乳动物胚胎发育中起着非常重要的作用。研究表明适当浓度的IGF-I能够提高体外培养的卵母细胞的成熟率，并通过抗凋亡作用提高体外胚胎的存活率，增加囊胚内细胞数目。但其作用机理还知之甚少。转基因动物和基因干扰技术作为研究基因功能的重要手段，可以用来探究基因在牛胚胎发育过程中的作用机理。为了阐明IGF-I在体外牛胚胎发育过程中的功能，本研究利用转基因技术，用脂质体和电击法将过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1和干扰载体pGCsi-IGF1导入牛胎儿成纤维细胞中，筛选得到稳定表达细胞株，为建立过表达IGF-I和低表达IGF-I的胚胎提供核供体，构建转基因胚胎模型探讨IGF-I在体外牛胚胎发育过程中的机理奠定了基础。本研究主要内容包括：
　　 ⑴通过RT-PCR方法从牛肝脏总RNA中扩增胰岛素样生长因子I(IGF-I)编码区cDNA序列，以T载体pMD19-T为克隆骨架构建中间克隆载体pMD19-T-IGF1。将IGF-I片段连接在双顺反子载体pIRES2-EGFP的BglII+SalI位点，构建过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1。限制性内切酶分析以及对测序结果表明，本研究所构建的的过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1结构与序列均与预期设计相符合。
　　 ⑵针对牛IGF-I基因的第594-622bp区域5'-GGCTCAGAAGGAAGTACAT-3'设计了一条发夹式RNA干扰片段，连接在干扰载体pGCsilencer-RFP上，构建了干扰载体pGCsi-IGF1。
　　 ⑶通过组织块贴附法成功分离出牛胎儿成纤维细胞，利用DMEM+10%FBS培养液在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下体外培养和传代，各代成纤维细胞在DMEM+20%FBS+10%DMSO培养液中冷冻保存；同时详细记录牛胎儿成纤维细胞的形态和生长特性，绘制了第5和10代牛胎儿成纤维细胞的生长曲线，并制作和分析了第5代细胞中期染色体的数目。通过以上分析证明，分离和培养的牛胎儿成纤维细胞在体外培养环境下，随代次增加，生长速度渐缓；第五代染色体数目正常(2n=60)，可以用第五代前的细胞进行转染实验。同时检测了牛胎儿成纤维细胞对筛选药物G418和潮霉素的耐受性，浓度稀释梯度实验结果确定G418的最佳筛选浓度为800μg/ml，潮霉素最佳筛选浓度为50μg/ml。
　　 ⑷用脂质体法和电击法转染牛胎儿成纤维细胞，48小时后分析转染效果并进行筛选。利用实时定量PCR技术检测了转染48小时后载体的表达效率，与对照组细胞相比发现，转染过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1的细胞中IGF-I表达量显著升高，约是对照组的40倍(P<0.05)，转染干扰载体pGCsi-IGF1的细胞中IGF-I表达量则显著降低，约是对照组的0.023倍(P<0.05)，表明构建的2个载体具有正常的功能，可以进行下一步的筛选。转染48小时后以800μg/ml G418和50μg/ml潮霉素为抗性筛选浓度，在DMEM+10%FBS培养液在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下连续培养10-12天，分别获得了表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的转基因克隆细胞。通过对转基因细胞基因组DNA的PCR扩增，证实外源基因已稳定整合在转基因细胞基因组中，可以用做核移植的核供体细胞，制备转基因胚胎模型，为进一步研究IGF-I在体外牛胚胎发育过程中的机理奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 真核过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1和干扰载体pGCsi-IGF1的构建

1 材料

1.1 主要仪器设备

1.2 试剂及耗材

1.3 组织材料

2 方法

2.1 牛IGF-I基因克隆以及pMD19-T-IGF1克隆载体的构建

2.2 真核表达型重组质粒pIRES2-EGFP-IGF1的构建

2.3 干扰载体pGCsi-IGF1的构建

3 结果

3.1 牛肝脏组织总RNA的制备及igfl全长cDNA片段的获得与鉴定

3.2 PCR产物的T-A克隆

3.3 牛igfl PCR产物测序结果

3.4 重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-IGF1的鉴定

4 讨论

参考文献

附图

第二章 牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

1 材料

1.1 主要仪器设备

1.2 活体材料

1.3 试剂及耗材

1.4 溶液配方

2 方法

2.1 牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

2.2 牛胎儿成纤维细胞生长曲线的测定

2.3 牛胎儿成纤维细胞中期染色体数目分析

2.4 牛胎儿成纤维细胞对G418耐受性的检测

2.5 牛胎儿成纤维细胞对潮霉素(Hygromycin B)耐受性的检测

3 结果

3.1 组织块贴附法分离培养牛胎儿成纤维细胞

3.2 牛胎儿成纤维细胞生长曲线的测定

3.3 牛胎儿成纤维细胞的染色体数目分析

3.4 牛胎儿成纤维细胞对G418的耐受性检测

3.5 牛胎儿成纤维细胞对潮霉素的耐受性检测

4 讨论

参考文献

第三章 牛胎儿成纤维细胞的外源基因转染以及转基因克隆细胞的筛选和鉴定

1 材料

1.1 主要仪器设备

1.2 试剂及耗材

1.3 溶液配方

2 方法

2.1 牛胎儿成纤维细胞的外源基因转染

2.2 单细胞克隆的筛选

2.3 SYBR GREEN I荧光定量Real-Time PCR法检测igfl mRNA的表达

2.4 稳定整合细胞克隆的鉴定

3 结果

3.1 脂质体转染牛成纤维细胞及筛选

3.2 电穿孔法转染牛胎儿成纤维细胞及筛选

3.3 SYBR GREEN I荧光定量Real-Time PCR法检测载体过表达和干扰情况

3.4 单细胞克隆的鉴定与分析

4 讨论

4.1 外源基因转染方法

4.2 载体生理功能的鉴定

4.3 单克隆细胞的筛选与鉴定

参考文献

结 论

图 版

文献综述 胰岛素样生长子I(IGF-I)基因在哺乳动物胚胎早期发育中的功能

致谢

攻读学位期间已发表和待发表的学术论文