俄罗斯大果沙棘(Hippophae rhamnoides ssp.Russia)共生Frankia菌多态性分析

摘要

俄罗斯大果沙棘是从俄罗斯、蒙古等国直接引入我国北方的一种人工栽培沙棘品种，其具有改良土壤、荒漠化治理、水土保持以及经济效益高等诸多优点。该树种之所以能在贫瘠土壤和恶劣环境中生长，主要是由于Frankia菌能与其形成根瘤共生体，从而将大气中的分子态氮还原成氨被植物吸收利用。目前，有关俄罗斯大果沙棘共生固氮的研究报道比较少，为了更好的开发和利用俄罗斯大果沙棘共生特性，本文对俄罗斯大果沙棘共生Frankia菌的遗传多样性进行了分析。主要研究内容及结果如下：
　　 ⑴采用改良的CTAB法，对5个不同地点63个俄罗斯大果沙棘根瘤样品进行DNA提取，以Frankia菌特异性引物FGPD807和FGPK333扩增nifD-nifK基因间隔区(IGS)，均得到了良好的扩增结果。
　　 ⑵对63个测试样品的nifD-ntfK IGS扩增产物用Hinf I、HaeⅢ和Taq I三种内切酶进行酶切，酶切共产生12条可分析条带，其中多态性条带11条，多态位点百分率为91.6%，表明俄罗斯大果沙棘共生Frankia菌有丰富的遗传多样性。
　　 ⑶通过对酶切图谱统计分析显示，63个供试样品可划分为8种IGS型(I型～VⅢ型)，不同IGS型在不同采样点的分布是不均匀的，有些基因型分布广泛，有些基因型分布具有区域性。
　　 ⑷对不同IGS型之间的Nei's遗传距离分析显示，不同基因型之间存在着较大的遗传分化，各基因型间的遗传距离介于5.72%～64.55%之间。没有发现不同基因型Frankia菌的亲缘关系与采样地点有相关性。
　　 ⑸通过对测定序列和已发表Frankia菌株的nifD-nifK IGS区域进行序列比对发现：不同基因型的测试菌株，其nifD-nifK IGS区域在核苷酸大小和碱基组成上存在差异，大小分为67bp和102bp两种类型。Frankia菌nifD-nifK IGS系统发育树显示：8个测试菌株均属于ClusterⅢ(胡颓子侵染组)，ClusterⅢ中的Frankia菌有着丰富的遗传多样性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述及研究意义

1.1 沙棘生物学研究进展

1.1.1 沙棘属植物的起源、分布

1.1.2 沙棘属植物的分类

1.1.3 俄罗斯大果沙棘的发展现状

1.1.4 俄罗斯大果沙棘的开发前景

1.2 弗兰克氏菌的研究进展

1.2.1 弗兰克氏菌的研究意义

1.2.2 内生菌及宿主植物对共生效应的影晌

1.2.3 弗兰克氏菌的应用

1.3 弗兰克氏菌遗传多样性研究进展

1.3.1 遗传多样性的概念及研究意义

1.3.2 遗传多样性的研究方法

1.3.3 PCR-RFLP在弗兰克氏菌遗传多样性研究中的应用

1.4 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 研究材料

2.1.1 根瘤样品

2.1.2 主要试剂

2.1.3 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 根瘤DNA的提取

2.2.2 基因组DNA的检测

2.2.3 PCR扩增

2.2.4. 扩增产物的限制性酶切分析

2.2.5 PCR产物的切胶回收

2.2.6 nifD-nifK IGS的克隆与测序

2.2.7 聚类分析

第三章 结果与分析

3.1 DNA提取的检测

3.2 nifD-nifK IGS的PCR扩增

3.3 nifD-nifK IGS的PCR-RFLP分析

3.3.1 扩增产物酶切图谱的建立

3.3.2 nifD-nifK IGS的酶切分析

3.3.3 不同基因型间的亲缘关系

3.4 重组质粒的检测

3.5 测序结果分析

3.5.1 nifD-nifK IGS的序列比对

3.5.2 系统发育分析

第四章 讨论

4.1 Frankia菌遗传多样性的影响因素

4.2 Frankia菌系统发育关系研究

4.3 nif基因在Frankia菌多样性分析中的应用

第五章 结论

参考文献

致 谢