大鼠IZUMO1与PDIA3相互作用以及IZUMO1在睾丸和顶体反应前后的精子中定位的探讨

摘要

哺乳动物受精是一个多步骤的复杂过程。其中精卵质膜的融合是受精过程的标志性步骤，但目前对其分子机理却知之甚少。综合该方向的研究成果和本实验室积累的研究结果以及精卵融合蛋白IZUMO1和二硫异构酶PDIA3的分子结构特点，我们猜测PDIA3与IZUMO1在精卵融合中可能相互作用，帮助IZUMO1实现其生物学功能。因此本实验解析这两种蛋白之间的相互作用以及IZUMO1在睾丸和顶体反应前后精子中的定位。
　　首先将本实验室已克隆好的大鼠IZUMO1插入到pET-32a中，构建原核表达载体p ET-IZUMO1。将原核表达载体pET-IZUMO1转化进大肠杆菌中大量表达，成功的得到融合蛋白HIS-IZUMO1。经过切胶纯化后的HIS-IZUMO1免疫昆明(KM)小鼠，制备了小鼠抗大鼠IZUMO1腹水多克隆抗体。分别用制备好的小鼠抗大鼠IZUMO1腹水多克隆抗体处理大鼠睾丸切片以及顶体反应前后的精子涂片，免疫组织化学和免疫细胞化学检测结果显示，IZUMO1广泛的表达于大鼠睾丸组织中;在顶体反应前的精子中，IZUMO1位于精子头部的顶体内;在顶体反应后的精子中，IZUMO1位于精子头部的赤道区。
　　此外，本实验还构建了酵母表达载体pGBK-IZUMO1、pGBK-IZUMO1(A)和pGBK-IZUMO1(B)，将其与本实验室保存的pGAD-PDIA3、pGAD-PDIA3(A)和pGAD-PDIA3(B)两两组合进行了酵母双杂交实验。结果显示，大鼠IZUMO1与PDIA3之间存在相互作用，并且IZUMO1的胞外段即IZUMO1(A)与PDIA3相互作用。同时，构建了带有HA标签的真核表达载体pcDNA-IZUMO1和带有HIS标签的真核表达载体pcDNA-PDIA3，带有HA和HIS标签的载体共同转染到293T细胞中，提取293T细胞的总蛋白做免疫共沉淀后，Western blotting检测结果显示:大鼠IZUMO1与PDIA3存在相互作用。

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符号说明

摘要

第一章 大鼠IZUMO1原核表达载体的构建与重组蛋白的分离纯化

前言

一 材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方法

二 结果

2．1 原核表达载体的构建

2．2 大鼠重组质粒pET-IZUMO1在大肠杆菌中的诱导表达及纯化

2．3 Western blot检测融合蛋白HIS-IZUMO1

2．4 融合蛋白HIS-IZUMO1的浓度测定

三 讨论

第二章 小鼠抗大鼠IZUMO1腹水多克隆抗体制备及纯化

前言

一 材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方法

二 结果

2．1 小鼠抗大鼠IZUMO1腹水多克隆抗体的鉴定

2．2 小鼠抗大鼠IZUMO1腹水多克隆抗体的效价测定

三 讨论

第三章 IZUMO1在大鼠睾丸组织和精子中的定位

前言

一 材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方法

二 结果

2．1 大鼠IZUMO1在睾丸组织中的定位

2．2 大鼠IZUMO1在精子中的定位

三 讨论

第四章 大鼠IZUMO1与PDIA3的相互作用

前言

一 材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方法

二 结果

2．1 酵母双杂交载体pGBK-IZUMO1、pGBK-IZUMO1(A)、pGBK-IZUMO1(B)的构建

2．2 酵母双杂交鉴定结果

2．3 真核表达载体的构建

2．4 Western blot及免疫共沉淀结果

三 讨论

第二部分 文献综述 参与精卵相互作用相关蛋白的研究进展

参考文献

致谢

攻读硕士期间参与的科研项目和发表的论文