MSTN RNAI和FSTN过表达基因转移体的构建

摘要

MSTN(肌抑素，myostatin)，也称生长分化因子8，属于TGF-β超家族，是骨骼肌生长和发育的负调控因子，会抑制骨骼肌的生长和发育。卵泡抑素(follistatin，FSTN)又称为FSH抑制蛋白，是单链糖蛋白。FSTN蛋白可以与MSTN黏合在一起，阻断MSTN的抑制功能，从而促进肌肉生长。敲除或敲减MSTN或过表达FSTN可以促进肌肉发育，有效增加肌肉量。本研究首先构建和筛选出MSTN的高效RNAi干扰载体;然后在筛选出的最佳干扰载体的上游插入核基质结合序列(MAR)，构建成含有MAR的干扰载体。通过mRNA和蛋白水平的验证，证实MAR干扰载体显著提高了干扰效率。当将含MAR的干扰载体转染到肌肉卫星细胞后，与肌肉发育相关的基因在敲减的细胞中的表达量显著提高。最后，将外源FSTN基因导入MAR干扰载体，构建成没有选择标志和载体骨架序列、安全的独立基因转移体，即pMAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN。该基因转移体可长期稳定降低MSTN基因的表达并增强FSTN基因的表达。利用该基因转移体制备了转基因小鼠，经验证该表达盒可以在个体水平上高效表达。本研究建立了安全有效的新型动物转基因载体系统，对生产安全转基因动物具有重要的实际意义。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词表

一、研究论文

前言

1 材料与方法

1．1 主要试剂及耗材

1．2 方法

2 结果

2．1 基因的克隆

2．2 过表达载体CAG-MSTN的构建与鉴定

2．3 干扰载体pU6-shRNA-CMV-DsRed的构建与鉴定

2．4 pMAR-U6-shRNA-CMV-DsRed载体的构建

2．5 pMAR-U6-shRNA-CMV-FSTN载体的构建

2．6 U6-shRNA-CMV-FSTN、MAR-U6．shRNA_CMv-FSTN基因转移体的构建

2．7 最佳干扰片段的筛选

2．8 pMAR-U6-shRNA-CMv-DsRed与pU6-shRNA-CMV-DsRed载体干扰效率的比较

2．9 干扰MSTN对于肌肉细胞中与肌肉发育相关基因的表达情况的影响

2．10 Western Blot检测蛋白水平的表达情况

2．11 转基因小鼠验证与分析

3 讨论

3．1 干扰载体的构建

3．2 MSTN最佳干扰载体的筛选

3．3 MAR序列对于干扰载体干扰效率的影响

3．4 MSTN敲减后对于肌肉发育相关基因的影响

3．5 MAR-U6-shRNA926-CMV-FSTN和U6-shRNA926-CMV-FSTN基因转移体的构建及其转基因小鼠的分析验证

4 结论

参考文献

二、文献综述 Myostatin基因在肌肉发育中的作用

1．Myostatin的发现及其功能

2．Myostatin基因的结构特点

3．Myostatin的作用机制

4．对Myostatin进行基因操作的研究应用

5．展望

参考文献

攻读硕士期间发表及待发表的论文

致谢