阿尔巴斯白绒山羊不同种类成体干细胞对转基因克隆效率影响的研究

摘要

阿尔巴斯白绒山羊作为内蒙古自治区经济价值很高的家畜品种之一，其转基因新品种的培育及规模化繁殖对当代畜牧业发展具有重大的意义。当前转基因新品种培育的主要技术是转基因克隆。成纤维细胞是目前阿尔巴斯白绒山羊转基因新品种培育中使用最多的核供体细胞，它的一个显著的不足之处是体外传代培养数目有限、基因转染效率偏低，这一缺点已成为其转基因新品种培育的瓶颈。本研究对分别以阿尔巴斯白绒山羊脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stemcells，ADSCs)、骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)和骨骼肌卫星细胞(Muscle-derived satellite cells，MDSCs)作为核供体细胞进行转基因克隆研究，观察不同类型的成体干细胞对转基因克隆效率的影响，为成功培育阿尔巴斯白绒山羊转基因新品种提供实验依据。
　　一、阿尔巴斯白绒山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs建系
　　1.ADSCs分离培养及鉴定
　　利用Ⅰ型胶原酶消化法对ADSCs进行分离培养，细胞免疫组织化学法对分离得到的细胞进行表面标记鉴定，通过成神经细胞诱导、成肌诱导和成胰岛β细胞诱导对其多能性进行鉴定。结果表明:ADSCs在体外增殖稳定，经Vimentin、CD49d、CD44和CD13染色呈阳性，CD34、CD106呈阴性。经神经细胞诱导、成肌诱导和成胰岛细胞诱导后ADSCs形态发生明显变化，并表达NSE、fast musclemyosin和insulin，结果表明ADSCs具备向三胚层细胞分化的能力。
　　2.BMSCs分离培养及鉴定
　　利用机械冲洗法对股骨中BMSCs进行分离培养，利用细胞免疫组织化学法对分离得到的细胞进行表面标记鉴定，通过成神经细胞诱导和成骨诱导对其多能性进行鉴定。结果表明:通过贴壁培养法，可使低丰度的BMSCs在体外实现分离扩增并且表达CD13、CD29、CD44、CD73，经过多次传代后仍无明显的衰老现象。BMSCs经神经细胞和成骨细胞诱导后均表达NSE和Osteocalcin，具有相应的分化能力。
　　3.MDSCs分离培养及鉴定
　　利用二次酶消化法分离培养MDSCs，同样利用免疫组化法对其进行表面标记鉴定，利用成神经细胞诱导、成肌诱导和成胰岛细胞诱导对其多能性进行鉴定。结果显示:MDSCs体外生长迅速，50代后无明显的老化现象，Desmin、α-Sarcomeric actinin、MyoD1、Myf5和PAX7呈阳性。MDSCs经神经细胞诱导、成肌诱导和成胰岛细胞诱导后细胞形态发生明显变化，并表达NSE、fast muscle myosin及insulin，表明MDSCs具备三胚层分化的多能性。
　　二、阿尔巴斯白绒山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs干性分析
　　1.我们初步探讨多能性与干性标记分子AKP、IL-6、Nanog、Oct-4、Rex-1、Sox-2和TERT以及三胚层标记分子Sox-1、Myod1和Gata-6在阿尔巴斯白绒山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs中的表达。结果显示ADSCs、BMSCs和MDSCs中均表达AKP、IL-6、Nanog、Oct-4、Rex-1和TERT，而不表达Sox-2。在ADSCs中，IL-6mRNA表达量相对较高，Nanog和Oct-4次之，Rex-1和TERT最低（P＜0.01）。在BMSCs中，Rex-1表达量相对较高，IL-6次之，Oct-4、Nanog和TERT较低(P＜0.01)。在MDSCs中，IL-6、Nanog和Oct-4表达量相对较高，TERT较低(P＜0.01)。RT-PCR结果显示，在ADSCs、BMSCs和MDSCs中均未检测到Sox-2 mRNA的转录。同时，在这三种细胞中均检测到不同程度Sox-1、Myod1和Gata-6的表达(P＜0.01)，且MDSCs的表达模式不同于ADSCs和BMSCs。通过Western-blot分析我们发现，在ADSCs、BMSCs和MDSCs中均未检测到Sox-2和Rex-1蛋白的表达，其余五种蛋白Oct-4、Nanog、 AKP、IL-6和TERT均有不同程度的表达(P＜0.01)，变化趋势与Q-PCR结果一致。结果表明这三种成体干细胞具有类似于胚胎干细胞的特性，其中MDSCs干细胞特性最明显，是最佳的种子细胞候选者。
　　2.将阿尔巴斯白绒山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs注射到NOD-SCID小鼠皮下后均未形成三胚层分化附属物的畸胎瘤组织。结果表明，阿尔巴斯白绒山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs有鲜明的非致瘤性。
　　三、以阿尔巴斯白绒山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs为核供体细胞生产转基因阿尔巴斯白绒山羊及鉴定
　　（一）细胞转染及转染后细胞多能性检测
　　以阿尔巴斯白绒胎儿成纤维细胞(Fetal fibroblast cells，FFCs)为对照，以pCDsRed2-1为外源载体，分别对ADSCs、BMSCs、MDSCs和FFCs进行细胞转染并进行筛选，同时对筛选得到的细胞进行多能性鉴定。结果表明:四种细胞转染48 h后瞬时转染效率无明显差异，但是经G418筛选后ADSCs-pCDsRed2-1、BMSCs-pCDsRed2-1、MDSCs-pCDsRed2-1和FFCs-pCDsRed2-1的荧光克隆形成率分别为78.26％、61.05％、85.40％和50.00％(P＜0.01)。ADSCs-pCDsRed2-1和MDSCs-pCDsRed2-1经定向诱导后同样强表达NSE、fast musclemyosin和insulin; BMSCs-pCDsRed2-1经神经细胞和成骨细胞诱导后均强表达NSE和Osteocalcin，说明外源基因的整合并不影响阿尔巴斯白绒山羊成体干细胞的多能性。
　　（二）转基因胚胎的生产及检测
　　分别以ADSCs-pCDsRed2-1、 BMSCs-pCDsRed2-1、MDSCs-pCDsRed2-1和FFCs-pCDsRed2-1为核供体细胞进行体细胞核移植生产转基因克隆胚胎。分别收取四类不同细胞来源桑椹胚期转基因克隆胚胎，通过Q-PCR和Western-blot检测DsRed2的表达量。结果表明:ADSCs-pCDsRed2-1， BMSCs-pCDsRed2-1和MDSCs-pCDsRed2-1来源的克隆胚胎融合率均较FFCs-pCDsRed2-1来源的胚胎高，8-细胞率和囊胚率相似。其中MDSCs-pCDsRed2-1融合率最高。在mRNA水平上，ADSCs-pCDsRed2-1、BMSCs-pCDsRed2-1和MDSCs-pCDsRed2-1来源克隆胚胎中DsRed2mRNA含量是FFCs-pCDsRed2-1来源克隆胚胎DsRed2 mRNA含量的2倍以上(P＜0.01)。在蛋白水平上，BMSCs-pCDsRed2-1来源克隆胚胎DsRed2蛋白相对表达量是FFCs-pCDsRed2-1来源克隆胚胎的1.29倍且差异显著(P＜0.01);而FFCs-pCDsRed2-1来源克隆胚胎DsRed2蛋白相对表达量分别是是ADSCs-pCDsRed2-1和MDSCs-pCDsRed2-1来源克隆胚胎的2.13倍和2.71倍。
　　（三）转基因阿尔巴斯白绒山羊的生产及检测
　　以4-6枚/只的标准将转基因克隆胚胎移入与排卵点同侧的受体羊的输卵管中。利用Western-blot方法检测转基因克隆羔羊背部皮肤中DsRed2的表达。结果显示，通过胚胎移植的方法我们分别得到得到成活的ADSCs-pCDsRed2-1来源转基因阿尔巴斯白绒山羊2只，MDSCs-pCDsRed2-1来源转基因阿尔巴斯白绒山羊1只和FFCs-pCDsRed2-1来源转基因阿尔巴斯白绒山羊1只，并且它们均表达DsRed2蛋白。
　　综上所述，本研究首先通过体外分离、培养并建立了阿尔巴斯白绒山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs细胞系，这三种成体干细胞在体外增殖能力强、经多次传代后仍保持良好的干细胞特性和分化潜能。而且与FFCs相比，经脂质体转染后这三类成体干细胞的转染效率均明显高于FFCs的转染效率;同时外源基因的随机整合并不影响其多能性。最后，通过将这三类成体干细胞作为核供体细胞研究其对转基因克隆效率的影响时，我们共得到不同细胞来源转基因羔羊4只，且这三类成体干细胞对转基因克隆效率并没有显著影响。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一篇 哺乳动物成体干细胞研究概述

1 成体组织来源的干细胞

2 不同种类成体干细胞概述

2．1 肌肉卫星细胞

2．2 成体造血干细胞

2．3 间充质干细胞

2．4 脂肪细胞

3 成体干细胞干性分析

3．1 成体干细胞的再生

3．2 成体干细胞静息态和标记

3．3 细胞移植

3．4 体内谱系追踪

3．5 实际干性和潜在干性

参考文献

第二篇 阿尔巴斯白绒山羊不同种类成体干细胞对转基因克隆效率影响的研究

第一章 阿尔巴斯白绒山羊不同种类成体干细胞分离培养及鉴定

前言

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 阿尔巴斯白绒山羊不同种类成体干细胞干性分析

前言

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 不同种类成体干细胞对阿尔巴斯白绒山羊转基因克隆效率的影响

前言

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

结论

致谢

攻读学位期间发表的学术论文