拟南芥高亲和性K+转运蛋白AtHAK5功能位点的鉴定

摘要

AtHAK5是KUP/HAK/KT转运体家族中的重要成员之一，是拟南芥高亲和性钾离子转运体，其基因表达受低钾条件的强烈诱导，编码蛋白在低钾条件下可以整合到细胞质膜，体现为对低钾环境的适应。本研究旨在找到拟南芥高亲和性钾离子转运体AtHAK5的功能氨基酸位点。通过生物信息学的分析，我们发现在AtHAK5氨基酸序列中具有10处潜在的磷酸化位点，我们假设这些磷酸化位点对于AtHAK5的功能至关重要，从潜在的磷酸化位点中选择17个氨基酸进行定点突变。分别将AtHAK5 cDNA和带有17种不同点突变位点的AtHAK5转化到athak5突变体中，通过多代选择，获得14种稳定表达的T3代转基因植株。实验发现在50μM KCl，150μM CsCl的条件下athak5突变体具有根生长受抑制的特异表型。所以若我们将全长AtHAK5 cDNA转化到athak5突变体中将使突变体丧失它的特异表型，回复到野生型的表型。如果将对AtHAK5正常功能重要的氨基酸发生了突变，将含有这样突变的AtHAK5 cDNA转化到athak5突变体中将不能使突变体回复到野生型的表型。这样通过表型分析我们便可知道哪些氨基酸为AtHAK5的功能氨基酸，哪些为非功能氨基酸。最终确定T549A和T666A为非功能氨基酸位点，如下11个位点为AtHAK5功能位点:F85L、T86A、T311A、T359A、P551S、D552N、S603A、S604A、K668E、S698A和V713L。这为深入了解低钾信号在植物细胞内转导的分子机制以及对培育出可以高效吸收和利用钾肥的农作物新品种提供一个理论基础和科学依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

一 引言

1．1 钾元素对植物的生理作用

1．1．1 钾元素的生理功能

1．1．2 钾元素对农副产品的影响

1．1．3 钾资源的现状

1．2 植物体吸收钾离子的机制

1．2．1 低亲和性吸收系统

1．2．2 高亲和性吸收系统

1．3 高亲和性K+转运蛋白AtHAK5的功能

1．4 研究目的与意义

二 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌种与质粒

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液、培养基及抗生素的配制

2．1．5 引物

2．2 方法

2．2．1 AtHAK5蛋白氨基酸磷酸化位点预测

2．2．2 带有突变位点pEASY-Blunt：：AtHAK5质粒的获得

2．2．3 带有突变位点的pPZP221：：AtHAK5双元表达载体的构建

2．2．4 带有突变位点的pPZP221：：AtHAK5转化农杆菌

2．2．5 转基因拟南芥的获得

2．2．6 转基因植物根长表型分析

三 结果

3．1 AtHAK5磷酸化位点预测

3．2 带有突变位点pEASY-Blunt：：AtHAK5质粒的获得

3．3 带有突变位点h均pPZP221：：AtHAK5双元表达载体的构建

3．4 农杆菌侵染拟南芥athak5突变体

3．4．1 athak5 T-DNA插入纯合突变体的鉴定

3．4．2 阳性点突变植物的抗性筛选

3．4．3 转基因植株PCR检测

3．4．4 转基因植物的筛选结果

3．4．5 拟南芥表型分析结果

四 结论与讨论

4．1 结论

4．2 讨论

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文

致谢