H3K27me3去甲基化酶UTX、JMJD3在小鼠孤雌胚胎中的表达模式

摘要

UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)和JMJD3(jumonji domain containing protein3)组蛋白去甲基化酶可以特异性地去除组蛋白H3第27位的三甲基化修饰，使基因得到激活。UTX与JMJD3在胚胎干细胞的多能性维持和肿瘤发生过程中起着重要的生物学作用。然而，到目前为止，UTX与JMJD3在早期胚胎发育过程中的作用还不清楚。
　　我们首先根据NCBI上GenBank数据库中小鼠UTX和JMJD3的mRNA序列，分别对应UTX和JMJD3设计了2对和3对引物。采用分段式PCR的策略，选择pMD19-T为过渡载体，将测序正确的分段PCR产物逐个连接，最终，成功地构建了具有T7启动子的pMD19T-T7UTX和pMD19T-T7JMJD3体外转录表达载体。体外转录后，UTX与JMJD3 mRNA产物电泳条带清晰，并且大小与预期相符。通过显微注射将UTX和JMJD3的mRNA注射进小鼠的卵母细胞中。经免疫荧光检测后，H3K27三甲基化修饰明显减少。说明，我们构建的UTX与JMJD3体外转录载体在细胞水平能够翻译出具有活性的蛋白。
　　之后，我们通过实时定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR)，对孤雌激活胚胎(Parthenogenetic activation，PA)中UTX、JMJD3的表达情况进行检测。结果表明，UTX与JMJD3在MⅡ期的卵母细胞中表达量较高。随着胚胎的发育，UTX与JMJD3开始逐步降解，到囊胚时期到达最低点。为了进一步揭示UTX与JMJD3在孤雌胚胎中的作用，我们采用siRNA(Small interferingRNA，siRNA)干扰技术，通过显微注射对MⅡ期的卵母细胞中的UTX和JMJD3分别进行敲减。经RT-qPCR检测，UTX和JMJD3的敲减效率分别为90％和70％。并且发现当敲减UTX和JMJD3中的任何一个，另一个基因表达量将会随之增加。对孤雌激活的8-细胞和桑椹胚进行免疫荧光染色，结果表明，单独干扰UTX或JMJD3均未检测到H3K27me3的荧光信号，而UTX和JMJD3双敲减组则检测到明显的H3K27me3信号。最后，又对孤雌激活的2-细胞进行UTX和JMJD3蛋白水平上的检测，Western blot结果与实时定量PCR相符，敲减UTX和JMJD3
　　其中一个，另一个的蛋白表达量也会相应的增加。以上结果说明，在mRNA和蛋白水平上，UTX和JMJD3存在功能互补。这一新的发现，为我们进一步研究UTX、JMJD3在小鼠植入前胚胎发育的机制提供了新的线索。

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论文说明

摘要

缩略词表

第一部分 研究论文 H3K27me3去甲基化酶UTX、JMJD3在小鼠孤雌胚胎中的表达模式

前言

一、材料

1．仪器和设备

2．耗材和实验动物

3．相关试剂及配制

二、研究内容

(一)LTTX与JMJD3体外转录或体的构建及在小鼠卵母细胞中的验证

(二)UTX与JMJD3在小鼠孤雌胚胎中的表达模式研究

三、结论

参考文献

第二部分 文献综述 H3K27me3修饰与胚胎发育间的关系

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文