基于红腹锦鸡基因组、转录组测序的羽毛色素调控机制研究

摘要

自人类基因组计划启动以来，基因组学逐渐成为研究人员关注的焦点。随着第二代测序技术的诞生，高通量、高深度的基因组测序被用于越来越多的非模式生物。就鸟类而言，2004年鸡基因组测序草图的完成，标志着禽类基因组时代的来临，围绕着鸟类基因组层面的进化关系研究也由此展开。鸟类羽毛颜色丰富多彩，从多种方面赋予鸟类独特而重要的优势，是研究脊椎动物颜色形成的理想模型，因此从鸟类基因组层面研究羽毛色素的调控机制具有极为重要的意义。
　　红腹锦鸡（Chrysolophus pictus）是原产于中国西部的著名观赏雉类。本研究结合红腹锦鸡基因组、转录组测序及羽毛色素成分的分析，对羽毛中黑色素和类胡萝卜素的合成和沉积机理进行了探索。利用二代测序技术，测得了红腹锦鸡全基因组序列和锦鸡羽毛毛囊组织转录组序列，并进行了组装，其中基因组大小为1.029Gb，注释到16，088个蛋白编码基因，10个样本的转录组组装序列57.66Gb，注释得到15，118个基因。经过进一步的物种间全基因组比较分析和不同颜色羽毛间的转录组表达分析，以及结合不同颜色羽毛中色素成分的鉴定结果，发现了一系列参与红腹锦鸡羽毛黑色素和类胡萝卜素调控的因子，为开展色素相关基因的功能研究奠定了基础。
　　1.红腹锦鸡与其它鸟类的全基因组比较
　　首先利用由红腹锦鸡基因组序列注释到的单拷贝同源基因构建了系统发育树，表明红腹锦鸡在系统发育地位上与鸡形目中火鸡亲缘关系最近，原鸡次之。然后以斑胸草雀为外群，对鸡、火鸡、红腹锦鸡的全基因组进行了比较分析。在基因拷贝数方面，红腹锦鸡有44个物种特异的基因家族和200个扩张的基因家族，其中的POU家族、涉及脂类代谢的家族和β角蛋白亚家族被认为与黑色素和脂色素的合成和积累有关。在基因共线性方面，红腹锦鸡假染色体中共有58个scaffold基因顺序发生了变化，包括3个大的基因组重排区，受基因组重排影响的基因包括15和黑色素相关基因和24个Hox基因，这些基因直接或间接地参与红腹锦鸡色素的调控。
　　2.红腹锦鸡与白腹锦鸡羽毛色素成分的鉴定
　　利用光谱和色谱的技术对锦鸡不同颜色羽毛的色素成分进行了鉴定。首先进行了拉曼光谱的测定，结果显示红腹锦鸡红、橙、黄色羽毛的羽枝部分和绿色羽毛的羽干部分检测到类胡萝卜素特征峰，而白腹锦鸡红、黄色羽毛显示为褐黑素特征峰，两种锦鸡绿色羽毛为真黑素特征峰。然后对各羽毛进行脂溶性色素的抽提，观察到只有红腹锦鸡的红、橙、黄色羽毛中可以提取到脂溶性色素，将这些物质进行质谱分析并将分子量与数据库比对，发现其中包含分子式为C40H54O和C40H56O2的类胡萝卜素，其中C40H56O2可能是叶黄素和玉米黄素这两种互为同分异构体的化合物。最后进行高效液相色谱的外标法分析，一方面利用叶黄素和玉米黄素标准品分析提取到的类胡萝卜素，另一方面利用PTCA和TTCA分析真黑素和褐黑素，色谱结果与光谱一致，即红腹锦鸡羽毛色素成分包括类胡萝卜素和黑色素，白腹锦鸡羽毛中只有黑色素。
　　3.转录组水平研究锦鸡羽毛色素调控基因
　　分别测定了红腹锦鸡和白腹锦鸡胸腹、颈项、上背、下背、尾羽的羽毛毛囊组织转录组。进行了两个物种同等部位羽毛和不同颜色羽毛的差异表达基因的筛选和聚类分析。对于黑色素相关基因，TYR、TYRP1、KIT、WNT7在真黑素为主要色素的上背羽毛中表达，ASIP以及溶质载体家族(solute carrier family)的一些成员在褐黑素为主的羽毛中表达。另外，ASIP和MITF由可变剪接产生的转录本中，ASIP-1A和MITF-1M在褐黑素富集的羽毛高表达，推测与褐黑素合成有关。对于类胡萝卜素相关基因，BCO2在不含类胡萝卜素的羽毛中表达，参与脂类代谢的基因APOA1和CYP2J主要在含有类胡萝卜素的羽毛中表达，推测可能与类胡萝卜素色素有关。另外，实时定量PCR分析发现，GSTA2和APOD与类胡萝卜素的沉积有关。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 红腹锦鸡生物学研究概述

1．1．1 基本情况

1．1．2 生物学研究现状

1．1．3 研究意义

1．2 鸟类羽毛色素的合成机理与调控机制

1．2．1 黑色素

1．2．2 类胡萝卜素

1．2．3 展望

1．3 全基因组测序的基本策略及鸟类基因组研究进展

1．3．1 DNA测序及其发展

1．3．2 序列的组装

1．3．3 序列的注释

1．3．4 基因组与生物进化及鸟类基因组研究进展

第二章 红腹锦鸡全基因组测序

前言

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果

2．2．1 红腹锦鸡全基因组测序及组装

2．2．2 红腹锦鸡基因组注释

2．2．3 红腹锦鸡基因组的演化

3 讨论

小结

第三章 红腹锦鸡与白腹锦鸡羽毛色素的分离鉴定

前言

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果

3．2．1 红腹锦鸡的羽毛颜色

3．2．2 拉曼光谱分析

3．2．3 脂溶性色素分析

3．2．4 高效液相色谱分析

3．讨论

小结

第四章 利用锦鸡羽毛转录组筛选色素相关基因

前言

4．1 材料和方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果

4．2．1 数据描述

4．2．2 红腹锦鸡与白腹锦鸡对应羽区差异基因的分析及寓集

4．2．3 红腹锦鸡与白腹锦鸡羽色差异表达基因筛选

4．3 讨论

小结

结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文