DNA错配修复系统缺陷与胰腺癌发生的相关性研究

摘要

目的:胰腺癌是一高度恶性肿瘤，近几年来发病率有逐年上升趋势，严重威胁着人类的生命健康。由于胰腺癌在临床上缺乏特异表现，恶性程度高，极易出现转移，就诊时3/4病人已属晚期。因此，提高胰腺癌的早期诊断率，并根据胰腺癌的分子和基因异常变化进行胰腺癌的预后评估以及治疗方案的选择已成为改善胰腺癌预后的关键。 近年来许多学者们发现了另一重要的致癌机制，即人类DNA错配修复系统(mismatchrepairsystem，MMR)缺陷诱导肿瘤发生。研究发现错配修复基因的改变可引起微卫星不稳定(microsatelliteinstability，MSI)，使癌基因、抑癌基因的突变积累，导致癌基因激活和抑癌基因失活，最终引起细胞恶变，肿瘤形成。 DNA错配修复基因位于癌基因和抑癌基因的上游，它们首先在遗传性非息肉性结直肠癌(hereditarynon-polyposiscolorectalcancer，HNPCC)中分离，其由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成，正常表达可保持遗传物质的完整性和稳定性，保证DNA复制的保真性。在此后的研究中人们逐渐发现MMR基因不仅与HNPCC这样的遗传性肿瘤发生相关，还与一些散发性肿瘤也有密切的联系。hMSH2和hMLH1是目前广泛研究的DNA错配修复基因。 微卫星不稳定性(MSI)是指微卫星中重复单位数量的增减，即简单序列重复次数的增减。微卫星不稳定性是DNA错配修复基因表达异常的重要表现。已有大量的实验证实MSI存在于HNPCC、部分散发性结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌等当中，并且是由于错配修复基因的异常造成的。更多的关于散发性结直肠癌和胃癌的研究进一步证实了MSI和hMLH1蛋白表达缺失、hMLH1启动子高甲基化之间有确切关系。胰腺癌属于HNPCC相关性肿瘤，其与MMR关系可能更为密切，由于胰腺癌具有不易早期发现、预后差、手术切除率低、标本难收集等特点，目前国内外学者关于MMR与胰腺癌发生相关性的系列研究报道尚未发现。那么DNA错配修复系统缺陷与胰腺癌发生有无关系?DNA错配修复系统缺陷和错配修复基因启动子甲基化有何关系?通过对上游基因的研究能否找到更为敏感，特异性更强的遗传标记而提高胰腺癌的早诊率呢?能否通过MMR与胰腺癌发生的相关性研究为胰腺癌的评估及治疗方案的选择提供直接依据呢? 本研究采用多种分子生物学方法，通过检测胰腺癌中的微卫星不稳定情况，错配修复基因hMLH1和hMSH2的蛋白表达以及启动子甲基化状态，来探讨错配修复系统缺陷与胰腺癌发生、发展及临床特征的相关性，力求寻找一种更为有效的遗传标记，为胰腺癌的早期诊断、治疗及预后提供指导信息，并为下一步基因治疗提供直接依据。 实验方法1.标本胰腺癌新鲜手术标本共35例，全部来自大连医科大学附属第一医院(2002～2004年)，经病理诊断证实后，保存于-80℃冰柜。标本包括胰腺癌组织及正常胰腺组织。 2.DNA提取提取基因组DNA，苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀收集，紫外分光光度仪定量，-20℃保存。 3.微卫星位点的分析所选5个微卫星位点分别为BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳证实无杂带，运用SSCP技术扩增反应产物，经热变性后，分别于室温及-4℃下，在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行垂直电泳14～16小时，EB染色30～45分钟后，紫外凝胶成像系统观察并保留结果。 4.免疫组化方法检测错配修复基因蛋白表达取冻存正常及胰腺癌组织石蜡包埋，切片，冷丙酮固定30分钟，PBS洗涤，加非特异血清封闭10分钟，分别加入抗hMLH1和hMSH2抗体，孵育30分钟，加入二抗。采用柠檬酸钠加热法抗原修复，辣根过氧化物酶-DAB显色。 5.Westernblot检测hMLH1和hMSH2表达组织匀浆上清液提取总蛋白，考马斯亮蓝定量。每次检测之前使用β-actin抗体对各样本的蛋白量进行剂量标准化检测。取等量总蛋白进行8％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，通过电泳将凝胶上的样本转印到硝酸纤维素膜上，分别加入抗hMLH1和抗hMSH2抗体进行孵育，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG温浴，最后用DAB显色。当硝酸纤维素膜上出现棕色谱带时终止显色。 6.hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化的检测运用甲基特异性PCR(MSP)技术，对DNA进行硫化处理，-20℃保存备用。hMLH1去甲基化引物序列为5'-TTTTGATGTAGATGTTTTATT-AGGGTTGT5'ACCACCTCATCATAACTACCCACA。hMLH1甲基化引物序列为5'-ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC5'-CCTCATCGTAACTAC-CCGCG。hMSH2去甲基化引物序列为GGTTGTTGTGGTTGGATGTT-GTTTCAACTACAACATCTCCTTCAACTACACCA。hMSH2甲基化引物序列为TCGTGGTCGGACGTCGTTCCAACGTCTCCTTCGACTACACCG。PCR反应为95℃，45sec；60℃，30sec；72℃，30sec，共35个循环，最后72℃延伸5min。取PCR产物5μl，与1μl上样缓冲液混合，在1.8％琼脂糖凝胶(加入EB0.5μg/ml)上电泳，紫外凝胶成像系统下观察。 7.判定标准与本人正常胰腺组织比较，胰腺癌组织有额外的DNA等位片段或出现等位片段移位即可判断为MSI。被检测的5个微卫星位点出现2个或2个以上的位点的不稳定，为微卫星的高度不稳定(MSI-H)；1个位点出现不稳定，为微卫星的低度不稳定(MSI-L)；没有位点出现不稳定，为微卫星稳定(MSS)。癌组织上皮细胞核不着色而周围组织上皮细胞着色，判定为蛋白表达的缺失。SSCP同时扩增甲基化(M)及非甲基化(U)，若扩增出M的特异性片段，则说明有甲基化；若扩增出U片段，则无甲基化。 8.根据临床资料和病理特征建立数据库，对照结果进行分析。 9.统计学方法采用SPSS11.0软件进行t检验，单因素方差分析，X2检验和Fisher精确概率检验，P＜0.05有统计学意义。 结论1.胰腺癌的发生存在MSI途径，胰腺癌中MSI的高检出率提示MSI是胰腺癌发生、发展过程中的频发事件，可作为胰腺癌诊断指标之一。胰腺癌中hMLH1的表达失活则可能导致MSI的发生。 2.hMLH1启动子甲基化与胰腺癌MSI及hMLH1蛋白表达缺失有关，而微卫星不稳定性和hMLH1蛋白表达缺失在胰腺癌发生过程中起重要作用。因此，hMLH1启动子甲基化是胰腺癌发生的重要机制之一。 3.胰腺癌中错配修复系统功能缺陷主要由于错配修复基因启动子甲基化引起，而非基因突变。 4.hMLH1表达异常可能导致胰腺癌的发生，hMLH1启动子甲基化是hMLH1基因失活的重要机制，且hMLH1的表达与胰腺癌的临床病理特征有相关性。

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论文一 胰腺癌中hMLH1和hMSH2表达与微卫星不稳定性的相关性研究

论文二 错配修复基因启动子甲基化与胰腺癌发生的关系

论文三 错配修复基因hMLH1表达与胰腺癌临床病理特征相关性的研究

本研究创新点的自我评价

综述 DNA错配修复系统与肿瘤

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