活细胞中BRCA1蛋白对DNA链损伤修复功能的原位分析

摘要

乳腺癌是妇女中最常见的肿瘤之一，在女性肿瘤中占18％，高居女性肿瘤发生率和死亡率的首位。在我国，乳腺癌的发生率在逐年增加，因此对乳腺癌相关基因的研究已成为该领域的热点。BRCA1(breastcancersusceptibilitygene1)是遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因，其突变与30％～45％的家族性乳腺癌、卵巢癌有关，而有家族性乳腺癌和卵巢癌家族史的人BRCA1突变率至少为80％。尽管在散发性乳腺癌中BRCA1基因突变很少见，但在散发性的乳腺癌和卵巢癌晚期该基因有一定程度的表达降低。 本文用一种激光系统，通过调节波长为405nm的激光在细胞核原位扫描的次数，在活的培养细胞核内制造出DNA的急性双链损伤，系统分析了BRCA1在DSBs修复中的功能。另外通过调节波长为365nm的激光的脉冲数研究了BRCA1对细胞内SSBs的应答，我们的实验为BRCA1功能研究提供了新的视野，为进一步阐明BRCA1的致癌机理奠定了基础。 一、材料和方法。 二、GFP融合BRCA1蛋白和各种片断对于微激光诱导的DNA双链损伤具有应答效应表明BRCA1的N末端和C末端在DSBs的应答中发挥作用，且两者分别参与不同的机制BRCA1由1863个氨基酸组成，蛋白分子量为220KDa。BRCA1蛋白相对较大，具有多个重要的结构功能域，其中最重要的为N-末端环指结构域和BRCA1C-末端还存在着含有两个串联的BRCT结构域。在我们的实验中证实这两个结构域对DSBs分别具有应答作用。失去BRCA1的N末端和C末端的中间片断对DNA双链损伤无应答，而BRCA1的N末端和C末端分别在DSBs部位形成Foci。BRCA1的N末端和C末端对DSBs应答速度和方式的不同提示两个结构域的作用机制不同。 三、GFP融合BARD1蛋白对激光微扫描后产生的DSBs的也产生应答，且其应答的动力学方式与BRCA1野生型的应答方式类似，提示着两种蛋白在体内对DSBs修复有协同作用实验中，我们制作了GFP-BARD1的融合蛋白，无论是否与BRCA1共转染，BARD1都对激光微扫描后产生的DSBs产生应答；而与BRCA1共转染的情况下，蛋白表达更稳定，比非共转染仅依靠内源性BRCA1的GFP-BARD1产生的Foci强度更强。用Fluoview软件分析后所得的BARD1产生的动力学与与BRCA1野生型的应答方式类似，提示着两种蛋白在体内对DSBs修复有协同作用。 四、BRCA1蛋白N末端除了含有RING结构域的区域对激光微扫描后产生的DSBs产生应答外，氨基酸101到氨基酸200的片断也对激光微扫描后产生的DSBs产生应答为了检测BRCA1蛋白N-末端对激光微扫描后产生的DSBs产生应答来自于RING结构域的作用，我们制作了BRCA1N-末端的六个小的蛋白片断。结果不仅含有RING结构域的氨基酸1-100、氨基酸1-200、氨基酸1-300蛋白片断对DSBs产生应答，不含有RING结构域的氨基酸101-200和氨基酸101-300蛋白片断也对DSBs产生应答，仅氨基酸201-300对DSBs无应答，提示氨基酸101-200含有重要的结构域或该区域能够与重要的修复蛋白发生相互作用。 五、BRCA1蛋白氨基酸101到氨基酸200间的4个肿瘤患者由来的点突变降低了N末端对激光微扫描后产生的DSBs产生应答的能力根据乳腺癌信息中心BCI记载，Y105E，P142H，P143K和E179C是4个在肿瘤患者中发生频率较高的点突变。目前对这4种点突变，尚无人对其所导致的致癌机理进行分析。东北大学加龄研究所癌化学疗法研究分野的千叶先生在美国制作了含有这4种突变的8种表达质粒。经过微激光原位扫描，我们发现含有这4种突变的8种蛋白对产生的DSBs都能产生应答，含有突变的蛋白对DSBs都能产生应答形成Foci的强度均低于相应的野生型蛋白，特别是点突变P142H，这可能与这些点突变引起肿瘤的机制相关。这些蛋白其蛋白表达水平均基本与野生型蛋白表达水平一致。 BRCA1蛋白氨基酸101到氨基酸200片断对激光微扫描后产生的DS-Bs应答的动力学方式与BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸100和BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸200相似，由于核心的环指结构域位于氨基酸24到氨基酸64之间，与BARD1相互作用，因此我们猜想BRCA1蛋白氨基酸101到氨基酸200片断是否同样与BARD1相互作用。我们用抗GFP抗体作IP，来沉降FLAG-BARD1蛋白，Western-blotting分别用抗BARD1抗体和抗GFP抗体检测，BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸100和BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸200与BARD1存在相互作用，然而，BRCA1蛋白氨基酸101到氨基酸200片断与BARD1并不存在相互作用。比较分别与BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸100和BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸200共转染的BARD1的表达量，我们发现BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸200共转染的BARD1的表达量远远低于与BRCA1蛋白氨基酸1到氨基酸100共转染的量，这也就提示了，BRCA1蛋白氨基酸101到氨基酸200部位与其他重要的蛋白存在相互作用，从而影响了氨基酸1到氨基酸100部位与BARD1的结合。然而这个重要的结合蛋白是什么，尚不清楚，还需要进一步的实验。 六、对于BRCA1蛋白的磷酸化，ATM蛋白不是唯一的激酶，NBS1蛋白影响BRCA1蛋白C-末端对DSBs的应答，而Ku80蛋白影响BRCA1蛋白N-末端对DSBs的应答BRCA1在ATM欠损细胞和H2AX欠损细胞中内，全长和各个片断均对DSBs产生应答，也就是说BRCA1对DSBs产生应答并不依赖于这两种蛋白，这也与之前的报道相一致。BRCA1全长和D775-1292以及N-末端在NBS1欠损细胞中均对DSBs产生应答，而BRCA1的BRCT结构域区在该细胞中对DSBs不应答。这就提示了BRCA1的BRCT结构域对DSBs的应答作用具有NBS1依存性。BRCA1的这两个高度保守区域在DNA-PKcs蛋白野生型和欠损型的细胞中对微激光扫描后所造成的DSBs都产生应答；BRCA1的C-末端在Ku80蛋白野生型和欠损型的细胞中对微激光扫描后所造成的DSBs都产生应答，而BRCA1的N-末端在Ku80蛋白欠损型的细胞中对微激光扫描后所造成的DSBs失去应答。 七、外源性BRCA对DNA单链损伤产生修复应答，且仅C末端对这种应答有重要意义在本实验中就是主要用365nm激光、F20、一次脉冲来制造DNA单链损伤。GFP融合BRCA1蛋白片断经过Western-blotting证实了蛋白活性。不同于扫描式激光所造成的现状损伤，用脉冲式激光制造的损伤呈现点状损伤，用Olympus共聚焦荧光显微镜可在损伤形成后连续动态的观察细胞中所想研究的GFP融合蛋白应答情况。不同于BRCA1对DSBs的应答，仅仅失去BRCA1的C末端的片断对就对DNA单链损伤无应答，当然BRCA1无N末端和C末端的中间段也没有应答，而单纯的BRCA1的C末端就能够在SSBs部位形成Foci。 八、内源性BRCA对DNA单链损伤也产生修复应答在XPA-UVDE的实验系统中我们加入了ActinomycinD的步骤。在紫外线照射前加入ActinomycinD的XPA-Vector细胞中紫外线损伤修复经路被抑制，而又没有形成SSBs，因此BRCA1没有形成Foci；在加入Acti-nomycinD的XPA-UVDE细胞中虽然紫外线损伤修复经路被抑制，但是由于UVDE的作用在紫外线损伤部位产生大量的SSBs，BRCA1在这些部位形成了Foci，这一结果和外源性的实验结果相吻合，进一步证明了BRCA1对SSBs具有应答效应。 九、BRCA对DNA单链损伤产生修复应答的生理学意义我们用siRNA的方法，在HeLa细胞中敲除BRCA1蛋白的表达，这样的HeLa细胞对产生SSBs的烷化类试剂MMS敏感性增强。这就提示BRCA1在细胞内对SSBs具有一定的修复功能，当缺失时就会引起细胞表型的改变。HCC1937是乳腺癌患者来源的细胞，在这个细胞中基因组BRCA1的3末端存在引起翻译提前终止的点突变，从而翻译出C-末端缺失的BRCA1蛋白。由于HCC1937BRCA1失去了对SSBs产生应答的最重要的结构域部分，因此如预计的那样，细胞本身对MMS有较高的敏感性，BRCA1蛋白表达敲除与阴性对照生存率没有明显的区别，这也反应出BRCA1仅C-末端对SSBR较重要。当在该细胞中表达正常的外源性BRCA1则可以增强细胞对MMS的抵抗性，恢复正常细胞表型。

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中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

第一部分活细胞中BRCA1蛋白对DNA双链损伤修复功能的原位分析

前 言

实验材料与方法

实验结果

讨 论

结 论

参考文献

论文二活细胞中BRCA1蛋白对DNA单链损伤修复功能的原位分析

前 言

实验材料与方法

实验结果

讨 论

结 论

参考文献

本研究创新性的自我评价

综 述BRCAl与DNA双链损伤修复的研究新进展

在学期间科研成绩

致 谢

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