小鼠皮肤切创愈合与磷酸化p38MAPK表达的时间相关性研究

摘要

目的： 皮肤损伤愈合是一个复杂的过程，包括血液成分凝集、炎症、肉芽组织形成、新生上皮覆盖、毛细血管生成、纤维化、结缔组织收缩等过程。p38MAPK(p38mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)为丝裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的一个重要的亚族，可通过细胞性的压力和炎症刺激发生磷酸化而激活，与重要的细胞反应有关，比如炎性反应和凋亡。本研究应用免疫组织化学和Western blot的方法，检测小鼠皮肤损伤区损伤后各时间磷酸化p38MAPK(phospho-p38MAPK，p-p38MAPK)的表达情况，探讨磷酸化p38MAPK在皮肤损伤愈合中的作用及其在损伤时间推断上应用的可能性。 实验材料与方法: 健康成年清洁级昆明系小鼠33只，体重35～40g，随机分为11组，其中1组为正常对照组。乙醚气体吸入麻醉，背部剪毛处理后，在背部中央做一纵行长1.5cm皮肤全层切口，深达筋膜。分别于伤后0h、3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d和14d将小鼠脱颈椎处死，取伤口处1.5cm×1.0cm皮肤组织。每组1/2皮肤固定后石蜡包埋，制作5μm连续切片；另1/2皮肤用冷生理盐水清洗后加蛋白裂解液匀浆，用于Western blot蛋白印迹分析。应用免疫组织化学和Western blot的方法检测30例小鼠皮肤，切创后各时间磷酸化p38MAPK表达情况，以非切创小鼠皮肤组织作对照，显微镜×400倍下，在损伤区及损伤周边区随机选取10个视野，计数细胞总数、阳性细胞数及阳性细胞率。应用Fluochem V2.0软件测各片段的平均光密度值，测得数据用均数±标准差(x±s)表示。用SPSS11.0 for Windows进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有显著性意义。 结果: 正常组织内含有少量的磷酸化p38MAPK。伤后6h，皮肤中可见少数多核粒细胞表达磷酸化p38MAPK。伤后12～24h，大量浸润的多核粒细胞和部分单核细胞磷酸化p38MAPK呈阳性。伤后1～5d随着时间的延长，磷酸化p38MAPK阳性细胞主要以单核细胞和成纤维细胞为主。伤后5～14d磷酸化p38MAPK表达主要在成纤维细胞中。伤后0～3h，磷酸化p38MAPK阳性细胞比率比较低，随着伤后时间的延长，磷酸化p38MAPK阳性率逐渐增加，12h达到高峰。伤后1～5d一直呈高表达状态，伤后3d时最高。伤后7～14d，磷酸化p38MAPK阳性率逐渐下降。除伤后3d与5d阳性细胞率无显著性差异外(P>0.05)，其它各组与相邻上组的阳性细胞数及阳性细胞率差异均有显著性意义(P<0.05)。Western blot的结果显示正常皮肤内有磷酸化p38MAPK的表达。伤后0～12h磷酸化p38MAPK蛋白含量逐渐增高，12h达到峰值。伤后1～5d磷酸化p38MAPK以3d时蛋白含量较高，伤后7～14d蛋白含量逐渐下降。除0h与对照组间平均光密度值差异无显著性意义外(P>0.05)，其余各组间平均光密度值差异均具有显著性意义(P<0.05)。 结论: 在小鼠切创愈合过程中磷酸化p38MAPK在损伤区对诱导中性粒细胞、单核细胞和成纤维细胞的凋亡起着非常重要的作用，同时磷酸化p38MAPK的规律性表达可用于损伤时间的推断。

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