BMP-7对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用及对核因子-κB p65核转移的影响

摘要

本文拟利用基因转染技术将重组鼠骨形态发生蛋白-7(rrBMP-7)基因转染心肌细胞，从细胞水平和器官水平探讨BMP-7基因和重组蛋白对心肌细胞缺血再灌注损伤的影响及其机制，为缺血再灌注损伤的防治提供新的途径。 研究材料与方法： 实验动物：生后72h wistar乳大鼠，雌雄不拘，由中国医科大学实验动物中心提供。 心肌细胞的制备与培养：断颈法处死乳大鼠后无菌条件下摘取左心室，D-Hank’s液洗去残血，分离出附着组织，剪成1 mm<'3>左右碎块。采用差速贴壁法制备心肌细胞。前36h培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷0.1mmol/L抑制非心肌细胞增殖。细胞爬片后以α-肌动蛋白免疫组化鉴定心肌细胞纯度为95％以上。培养成活3d的心肌细胞，传至35mm培养皿(含15％胎牛血清的DMEM培养基)，使培养皿的细胞数在2×10<'5>个左右。 实验一：随机分4组：pcDNA3.1-rrBMP-7质粒组(转染实验组)、pcDNA3.1组(空载体对照组)、FuGENE 6转染试剂对照组和细胞空白对照组。pcDNA3.1(+)-rrBMP-7构建后进行pcDNA3.1-rrBMP-7扩增、纯化和鉴定。将含pcDNA3.1-rrBMP-7基因的质粒2μl与FuGENE 6转染试剂98μl混合，室温下静置30rain后将此混合物加入实验组细胞，37℃、5％CO<,2>条件下培养箱中转染72h后观察BMP-7表达情况。空载体组转染只含pcDNA3.1的质粒；FuGENE 6转染试剂对照组细胞转染的混合物中不加质粒，加入等量PBS；细胞空白对照组细胞不加转染试剂，加入等量PBS。逆转录-PCR法检测转染rrBMP-7基因mRNA的表达。免疫细胞化学和Western blot法检测BMP-7在心肌细胞中的表达。 实验二：随机分为3组，正常对照组(C组)：未经缺血/再灌注处理；模拟缺血再灌注组(IR组)：培养的心肌细胞缺氧120min，复氧240min；基因转染组(BT组)：转染BMP-7基因后，再行缺氧120min/复氧240min。每组重复8次。模拟缺血再灌注组和基因转染组细胞吸去细胞培养液，换用95％N<,2>+5％CO<,2>混合气体饱和30min的无糖DMEM培养液2ml，置于缺氧罐中缺氧培养2h，复制“缺血”模型。再灌注期取出培养皿，培养液换用混合空气饱和的．DMEM 2ml，放回5％二氧化碳孵育箱中继续培养4h。对照组细胞一直置于CO<,2>培养箱中，基因转染组缺血/再灌注损伤处理前进行基因转染。心肌细胞搏动计数和观察形态学变化。采用台盼蓝排斥法检测心肌细胞存活率。应用流式细胞仪PI染色法和TLINEL法测定细胞凋亡率。测定心肌酶乳酸脱氢酶(LDH)和磷酸肌酸激酶(CPK)含量，丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。荧光成像系统测定细胞内钙离子浓度。免疫细胞化学和Western blot法检测NF-κB p65在心肌细胞核中的表达。以细胞核中出现棕黄色颗粒为NF-κB p65阳性结果。 实验三：建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，随机分为单纯缺血再灌注组(IR组)，心肌缺血再灌注+BMP-7治疗组(B组)和假手术对照组(Sham组)。各组分设缺血30mim后再灌注4h和24h时相点，Sham组只设4h时相点作总体对照；另用32只大鼠随机分为缺血再灌注组和缺血再灌注+BMP-17治疗组，以行TTC染色测定心肌梗死范围。B组于再灌注前股静脉给予rhBMP-7 250gg/kg，Sham组和IR组给予等量生理盐水。于实验结束时取心腔内血检测LDH和CPK含量，心肌匀浆检测MDA含量、SOD活性，TTC法测定心肌梗死面积，HE和电镜下观察心肌组织学变化。TUNEL法测定细胞凋亡。免疫组织化学和Western blot检测NF-κB p65在心肌细胞核中的表达。 所有数据以平均数±标准差表示，使用SPSS 13.0统计软件进行方差分析，组间比较采用t检缎验，P<0.05为有统计学意义。 实验结果 实验一：入门载体质粒pMD 18-T Simple-BMP-7 DNA测序结果和IGene Bank中所提供的已知序列(XM342591)进行比对，结果表明，所克隆的BMP-7 cDNA从起始密码子到终止密码子共1293bp，与已知序列完全一致。将质粒pcDNA3.1-BMP-7用HindⅢ/BamHⅠ进行酶切检测，释放出5406bp载体片段和1293bp BMP-7片段。RT-PCR结果中，实验组出现471bp条带，表明实验组心肌细胞中有BMP-7基因在mRNA水平的表达；空载体组、FuGENE 6转染试剂对照组和细胞空白对照组则无相应条带出现。实验组转染质粒pcDNA3.1-BMP-7后，在心肌细胞胞质中有BMP-7表达，呈棕黄色。Western blot检测到大小为18kD的特异性蛋白质条带。 实验二：模拟缺血/再灌注组(IR组)的细胞存活率降低。基因转染组的细胞存活率明显高于缺血/再灌注组。与对照组相比，IR组搏动频率明显减慢，基因转染组搏动频率明显高于IR组。对照组可见小亚二倍体峰；瓜组凋亡率明显增加。而BMP-7基因转染预处理则使细胞大部分存活，凋亡率明显低于瓜组。心肌细胞再灌注后LDH、CPK和MDA含量较正常心肌细胞显著升高。BMP-7基因转染预处理后LDH活性较IR组明显降低。IR组SOD活性较正常对照组明显下降，BMP-7基因转染预处理后SOD活性均较IR组升高(P<0.01)。细胞内钙离子测定结果显示，IR给[Ca<'2+>浓度较正常对照组明显升高(P<0.01)，BMP-7基因转染预处理后[Ca<'2+>]含量较IR组降低(P<0.01)。IRNNF-κB p65核染色和蛋白积分光密度比与正常对照组相比显著性增高(P<0.01)。BMP-7基因转染预处理后减少了NF-κBp65核染色和积分光密度比(P<0.01)。 实验三：心肌缺血/再灌注过程中各组MDA、SOD、LDH和CPK含量变化与Sham组相比，IR4h组和24h组的MDA、LDH和CPK含量均明显升高，SOD活性降低(P<0.01)，表明IR组心肌组织因缺血/再灌注损伤造成氧自由基和酶学的改变。B组MDA、LDH和NCPK含量与IR组相比明显减少，与IR组比较差异有显著性(P<0.01)；SOD较IR组明显恢复(P<0.01)。与R组同时点相比，B组梗死心肌重量(IS)及其占缺血危险区心肌重量百分比(IR/AAR％)均显著减少(P<0.01)。电镜超微结构观察发现，Sham组心肌细胞超微结构未见明显异常；IR组心肌细胞超微结构损伤严重；与IR组比较，B组心肌细胞超微结构损伤均有不同程度的改善。TUNEL法测定细胞凋亡结果显示，与IR组相比，B组凋亡细胞明显减少。IR组NF-κB p65核染色和积分光密度比与正常对照组相比显著性增高(P<0.01)；BMP-7基因转染预处理后减少了NF-κB p65核染色和积分光密度比(P<0.01)。 研究结论： 1、应用本文介绍的方法，成功地构建了BMP-7真核表达质粒并在心肌细胞中大量表达，为应用于抗缺血再灌注损伤的研究创造了条件。 2、BMP-7转染可对抗缺氧复氧对心肌细胞的损伤，其机制与提高心肌细胞抗氧化损伤能力，对抗缺氧复氧引起的细胞内钙超载有关。 3、大鼠在体研究表明，rhBMP-7缩小梗死面积，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。可能与其抑制脂质过氧化，保护抗氧化酶活力有关，有望成为心肌再灌注疗法的辅助用药。 4、细胞水平和在体水平研究都表明BMP-7可减少细胞凋亡的发生，其保护作用可能与抑制NF-κB p65核转移有关。

目录

中国医科大学研究生学位论文独创性声明及版权使用授权书

中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

论文一 重组鼠BMP-7真核表达载体的构建及在心肌细胞中的表达

前言

材料与方法

实验结果

论文图片

讨论

结论

论文二 转染重组鼠BMP-7基因对原代培养心肌细胞模拟缺血再灌注损伤的的保护作用及对核因子-κB p65核转移的影响

前言

材料与方法

实验结果

论文图片

讨论

结论

论文三 重组人BMP-7预处理对大鼠缺血再灌注损伤的保护作用及对核因子-κBp65核转移的影响

前言

材料与方法

实验结果

论文图片1

论文图片2

讨论

结论

本研究的创新性自我评价

参考文献

综述　骨形态发生蛋白-7的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介