卡培他滨与放射线照射联合治疗子宫颈腺癌的效果与机制探讨

摘要

卡培他滨(capecitabine，CAP)是一种口服型5—氟尿嘧啶(5—fluorouracil，5—FU)前体类抗肿瘤新药。CAP的药物设计，使其本身无毒无活性，在胃肠道可以原药形式快速吸收，在肝脏和肿瘤组织中三种酶的作用下转化形成5—FU而发挥抗肿瘤活性。最终5—FU由二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrinudine dehydrogenase，DPD)代谢失活。在其转化过程中，胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)是其活化最后一环的一个限制酶，TP的特点在多数实体肿瘤组织中浓度较高，明显高于正常组织。这使得CAP在正常组织中生成5—FU量较少，而在肿瘤组织局部可有高浓度5—FU生成，大大增强了抗肿瘤活性，降低了5—FU对正常组织的毒副作用。因此，CAP全身毒性反应轻且选择性抗肿瘤，是目前口服制剂中唯一能超过静脉给药的氟尿嘧啶类药物，弥补了5FU毒性大用量受限的缺撼。临床上已被用于紫杉醇、阿霉素等耐药的复发转移性乳腺癌及晚期结肠癌等患者的治疗，取得了很好的效果。关于CAP疗效方面的研究，由于TP是CAP选择性作用于肿瘤的关键酶，而成为研究的焦点。人们致力于增加TP的表达来提高CAP的疗效。研究显示，放射可使多种肿瘤组织TP表达明显增高，CAP和放射联合应用无论用于辅助治疗、术前放化疗、还是姑息治疗，均能得到较好的效果，是一种有前途的肿瘤治疗方法。另外研究还发现，DPD在CAP治疗中也发挥着重要作用，TP/DPD的比值更直接的关系到CAP的疗效。提示在化疗之前测定肿瘤相关酶的水平，能选择到更适合接受CAP治疗的人群。 子宫颈癌有着较高的发病率，其治疗主要还是以手术和放疗为主，可使部分患者得到根治或缓解，但有部分患者单纯放疗仍然预后不佳。尤其是宫颈腺癌，不如宫颈鳞癌对放射线敏感，临床期别较晚、淋巴结有转移的患者，初始治疗后很快又复发、转移。且其发病还有逐渐增加趋势。因此为改善预后，临床迫切需要探讨对宫颈腺癌更为有效的疗法。近年来新辅助化疗即术前或放疗前进行化疗，确实一定程度上提高了手术或/和放疗的效果。故而寻找对宫颈腺癌更有效的新辅助化疗方案的有关研究出现许多。CAP也已被用于多种人宫颈癌细胞株动物移植模型中进行研究，显示出了一定的抑癌效果，在人宫颈腺癌HeLa细胞株动物移植模型中CAP的抑瘤率可达34.6％。但CAP与放射联合在宫颈腺癌中的作用如何尚未见报道。介于CAP高效低毒的药物特点和5—FU所具有的放射增敏作用，将CAP与放射联合用于宫颈腺癌，效果值得期待。因此本研究采用人子宫颈腺癌细胞株异种移植于裸鼠建立动物模型，观察了CAP和放射线联合治疗在宫颈腺癌中的抗肿瘤效果。并通过放射线照射对宫颈腺癌细胞TP、DPD酶影响的研究，及观察联合治疗后宫颈腺癌细胞周期的变化，对其联合治疗效果的机制进行了探讨。 实验材料和方法： 一、实验材料 1、实验动物：雌性BALB/c nu/nu裸鼠(5或6周龄，体重约20克)约220只。 2、细胞株：人宫颈腺癌CAC—1细胞株从日本札幌医科大学获得，人宫颈腺癌HeLa细胞株由中国医科大学盛京医院感染科实验室提供。 3、主要试剂及药品：CAP由F—Hofmann—Roche(Besle Switzerland)提供。5—FU购买于Kyowa Hakko Co(Tokyo Japan)和上海旭东海普药业公司。培养基(海克隆生物化学制品北京有限公司)；0.1mg/ml考马斯亮蓝溶液(进口分装，上海化学试剂采购供应站)；牛血清白蛋白(Sigma公司)；ELISA法测定TP酶的试剂盒(德国罗氏公司)；总RNA提取液Trizol(东胜创新实验技术有限公司)；cDNA第一链合成逆转录试剂盒、PCR试剂盒、Taq DNA、聚合酶DNA Marker(大连宝生物工程有限公司)；TP、DPD引物(上海Invitrogen英俊生物技术有限公司合成)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma公司)，DMSO试剂二甲基亚砜(北京夏斯生物技术有限公司)，碘化丙啶(PI)(sigma公司)。 4、主要实验仪器和设备： 超净工作台(苏州净化设备厂)；瓦里安直线加速器2300C/D—SN293(美国)；超声粉碎机UP200H(德国)；DV600分光光度计(美国)：振荡机RS—232(美国)；酶标仪GIS—1000 Tanon(上海天能科技有限公司)；紫外分光光度仪Wellscan MK3(德国)；电泳仪BIO—RADpower/PAC300(美国)；PCR仪PTC—100(美国)；凝胶成像分析系统(基因有限公司)；流式细胞仪(FACS—440型)；Mitsubishi电子射线装置(机型EXL-15DP，4MeV，剂量率5Gy/分)。 二、实验方法 1、人宫颈腺癌CAC—1细胞株动物移植模型建立及治疗效果评价 在每只裸鼠左下肢外上方皮下，接种含2×106个细胞的CAC—1单细胞悬液0.2ml。在局部有肿瘤块生长并达一定程度时开始进行肿瘤治疗。治疗前将携瘤鼠分成对照组、CAP组、5—FU组、放射组、CAP+放射组和5—FU+放射组。并设肿瘤大小不同的两大组，在大、小瘤组又分别分出对照组、CAP组、放射组、CAP+放射组。CAP、5—FU每天被分别投给它们最大耐受剂量(MTD)的1/2或2/3。每周投药6天，连续投药两周。对需行放射的携瘤鼠分别于投药第4天进行一次性4、5、6Gy局部照射，以及投药周的第1、2、4、5天进行日一次2Gy的局部照射，两周共照射8天。药物、照射等的疗效评价通过观察肿瘤体积的变化来进行。计算肿瘤增殖百分率，将肿瘤增殖百分率与所经过的时间绘制成肿瘤增殖曲线图，以此评价肿瘤被抑制程度。T2.5表示肿瘤体积从治疗第1天的体积到生长达其2.5倍时所需的时间，以此推算肿瘤生长延迟天数。 2、人宫颈腺癌HeLa细胞TP，DPD酶表达的测定 将宫颈腺癌HeLa细胞按X线照射的不同剂量分成对照组(0Gy)及2Gy、6Gy放射组。分别于照射前1天(第0天)，照射后第1天，第3天，第5天，第7天，第9天收集细胞，制成测定样本冻存。ELISA测定HeLa细胞照射前后TP酶蛋白含量。RT-PCR检测HeLa细胞放射前后TP，DPD酶mRNA表达。 3、人宫颈腺癌HeLa细胞周期的测定 先以MTT法行5—FU处理48h半数抑制浓度(IC50)测定，为125μg/ml。再将HeLa细胞分成对照组(不加药，不照射)、5—FU组、放射组、5—FU+放射组(药物和放射同时投给)。各组根据不同时间经过又分成12、24、48h三组。药物组是以48h IC50浓度的5—FU处理相应各组细胞，12、24、48h后将细胞收集。需照射的各组细胞在室温下进行单次6Gy的X射线照射，照射后继续培养12、24、48h再收集细胞。行冰乙醇固定备测。细胞周期测定前先行PI染色，后以流式细胞仪检测各组细胞周期变化，测定G0/G1、S、G2/M期细胞。 结论： 1、对于宫颈腺癌CAC—1应用CAP与放射联合治疗能产生相互协同增效作用，有明显的肿瘤抑制效果，是一种有效的治疗子宫颈腺癌的方法。其效果优于单纯CAP及单纯放射的治疗，也优于5—FU直接和放射联合的效果。CAP对放射的增强作用比5—FU强。 2、CAP与放射联合治疗的效果与CAP药物浓度、放射剂量、照射方法及肿瘤大小有关。2/3MTD CAP分别和5、6Gy及2Gy×8放射联合治疗时，肿瘤抑制的效果较好。CAP与小剂量多次放射方法的联合治疗，较CAP与单次放射方法联合，更显示出了明显的抑瘤效果。体积较大的肿瘤，对CAP与放射联合治疗的反应敏感，比体积较小的肿瘤治疗效果好，可能CAP与放射联合治疗对较晚期子宫颈腺癌更为有效。 3、放射线照射，能提高子宫颈腺癌HeLa细胞TP酶的mRNA表达和TP酶蛋白水平，而DPD酶mRNA表达不受影响，因此放射后HeLa细胞TP/DPD比值升高，能增加其对CAP的敏感性。 4、5—FU与放射联合，两者对HeLa细胞周期均有影响，其细胞G2/M、S及G0/G1各期都有变化，但主要还是以S期细胞阻滞即5—FU的影响为主。其联合作用引起的细胞周期变化，在处理后的24小时最为显著。HeLa细胞表现出对5—FU的作用比对放射更敏感，可以认为在两者的联合作用中，5—FU通过改变HeLa细胞周期而对放射效果的影响较大，相反放射对5—FU影响较小。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

前 言

第一部分 卡培他滨与放射线照射并用对人子宫颈腺癌裸鼠移植动物模型的抗肿瘤活性研究

前 言

实验材料与方法

实验结果

讨 论

结 论

第二部分 放射线照射对人宫颈腺癌HeLa细胞TP、DPD酶表达的影响

前 言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

第三部分 氟尿嘧啶及放射线照射联合对人宫颈腺癌HeLa细胞周期的影响

前 言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述：卡培他滨抗肿瘤的研究

在学期间科研成绩

致 谢

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