再生心肌细胞的另一新来源——人胎盘组织

摘要

目的： 心血管疾病是影响人类健康的主要疾患之一，在临床上其发病率与死亡率较高。各种病因导致心肌细胞凋亡、坏死，造成心肌细胞大量丢失，受损的心肌被瘢痕组织所替代，最终导致心功能衰竭，甚至死亡。其中以心肌梗死、冠心病最为常见。对于缺血性心脏病，传统的治疗方式是通过药物、介入、溶栓等方法恢复缺血区的血流量，但并不能阻止心肌不可逆性损伤的进程[1]。心脏移植可以治疗严重的心功能衰竭，但这一有效的治疗措施受供体来源和免疫排斥反应等的限制。尽管研究发现，心肌中存在具有再生能力的心肌前体细胞(cardiac progenitor cells，CPCs)在心梗后可发生分裂增殖，但CPCs数量有限，只能修复毛细血管闭塞后的亚临床病变，而不能完整地修复组织，不足以阻止心室重构、心功能衰竭的发生。随着人类对干细胞认识的加深，利用干细胞分化潜能再生心肌细胞，修复受损的心肌组织，恢复心脏功能，已经成为目前治疗心功能衰竭的一种新的策略，这种可用于移植的干细胞称为种子细胞。 目前多数干细胞治疗心脏病仅处于细胞培养与动物模型方面，在临床尝试中多采用自体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和外周血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，回避了应用胚胎干细胞的伦理与法律问题，同时自体成体干细胞移植也回避了免疫排斥反应问题。但是，间充质干细胞在成人骨髓内含量极低，仅占有核细胞数的0.01-0.1％，并且心血管疾病多好发于中老年人，因骨髓组织随年龄增长红骨髓减少，黄骨髓增多，因此患者骨髓内干细胞数量与质量大多降低，患者得不到足够数量的干细胞，所以寻找新的干细胞来源及提高其临床应用效果成为研究热点。 早在2000年即有学者从冻存的胎盘组织中分离培养出贴壁细胞，近年来，越来越多的实验证实胎盘中存在大量干细胞，并且这种胎盘来源的干细胞具有多向分化潜能，已证实可以向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和肌细胞方向分化[6～8]，但对心肌细胞方向分化的研究报道甚少。本研究从人胎盘中分离干细胞，并诱导其向心肌细胞分化，探讨其作为种子细胞治疗心肌梗死的可能性，为临床冠心病的治疗提供一条新思路。 方法： 1、胎盘细胞提取：取足月剖宫产新生儿的胎盘(来源于沈阳菁华医院妇产科健康足月剖宫产新生儿胎盘组织)，剥离子体面蜕膜，剪取蜕膜下组织，PBS(含100U/ml青链霉素)冲洗两次，室温静置10min，将组织块剪碎约1mm3，均匀置于培养皿底部，应用10％DMEM培养基(含10％FBS、0.1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青链霉素、0.1mmol/L β-巯基乙醇)培养于37℃、5％CO2的培养箱，每3d换液1次，待细胞沿培养皿底部生长面积达80％-90％时，按常规方法传代，传代3次后用于检测及诱导分化。 2、胎盘细胞表型测定：取第3代细胞，以0.25％胰酶消化3min后，调整细胞数为1×106，加入5μl小鼠血清封闭15min后，加入鼠抗人PE标记的单克隆抗体CD13、CD14、CD73、CD90、CD166、HLA-DR，及FITC标记CD29、CD31、CD44、CD45、CD105、HLA-ABC抗体各20min，分别设PE、FITC、空白对照组，冰上避光反应20min，PBS洗2次后，4℃1000r/min离心5min，弃上清后加入200μl冷PBS吹打混匀后，流式细胞仪检测。 3、心肌细胞分化培养：采用悬滴法培养：取对数生长期的细胞，胰酶消化并吹打成单个细胞后，制成2.5×104 cells/ml细胞悬液，分化培养液为含有0.1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青链霉素、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、20％胎牛血清的IMDM。细胞悬液以20μl/滴接种于直径10cm的培养皿盖上，培养皿内中放入10ml无菌PBS，盖上培养皿盖，置于37℃、5％CO2的培养箱中，3d后，从单个悬滴中吸出形成的悬浮拟胚体(embryonic bodies，Ebs)，转入至预先以0.1％明胶涂抹的24孔细胞培养板中。 4、检测Ebs分化率：每天于显微镜下观察Ebs的生长情况及出现跳动细胞的时间，以各组Ebs 中出现跳动心肌细胞为分化阳性，并分别与每组总的Ebs的数量相比，为分化率[10]。计数Ebs形成的第8d、9d、10d、11d、12d的分化率。 5、免疫细胞化学检测α-sarcomeric actin表达：将孔板内分化细胞重新接种于新的孔板中，同时用未经诱导分化的人胎盘干细胞作对照，待24 h细胞贴壁伸展后进行检测：具体步骤按SABC染色试剂盒说明书操作，弃掉孔板内培养液，PBS(0.02mol/L，pH7.2-7.6)洗3遍，4％多聚甲醛固定30min，0.3％H2O2灭活内源性酶，BSA封闭后分别加入1：200稀释的小鼠抗人α-sarcomeric actin抗体，湿盒内4℃孵育过夜，用生物素标记的山羊抗小鼠IgG二抗孵育1h，光镜下观察。 6、细胞免疫荧光检测心肌特异性肌钙蛋白表达：将孔板内分化细胞重新接种于新的孔板中，同时用未经诱导分化的人胎盘干细胞作对照，待24h细胞贴壁伸展后进行检测：PBS洗3遍后，4％多聚甲醛固定30min，封闭液封闭30min，加入1：100稀释的兔抗人cTnI抗体，湿盒内4℃孵育过夜，FITC标记山羊抗兔1gG二抗(1：100)室温避光孵育2h，PBS洗3遍，PI染核后封片，荧光显微镜下观察。 7、RT-PCR检测心肌特异性基因．Anf、β-MHC mRNA表达：收集第12d Ebs中跳动细胞的总RNA，用RT-PCR方法检测Anf、β-MHC mRNA，操作步骤严格按照说明书进行。 结果： 1、组织块培养11d左右，可见后有少量细胞爬出，随着细胞数目的增多，贴壁的组织块逐渐脱落，细胞呈漩涡状生长或成簇生长，胞体变得细长，形态类似成纤维细胞，培养3W左右，细胞可达到80％融合，细胞经传代贴壁后，细胞变成梭形并逐渐形成干细胞集落。 2、流式细胞仪检测显示：来源于人胎盘组织的第3代细胞表达CD29、CD105，不表达CD13、CD14、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD166、HLA-ABC、HLA-DR。 3、悬滴分化培养法培养3d后将形成的白色的Ebs接种到24孔培养板中，接种后5d(悬滴后8d)，于倒置显微镜下观察到Ebs周围可见到自发性节律收缩的心肌细胞团，不同Ebs中的心肌合胞体显示出的收缩性和形态有所不同。 4、α-横纹肌肌动蛋白的细胞免疫化学检测发现细胞胞浆内有棕黄色颗粒的阳性结果，阳性率为47.2％，与对照组(5.6％)比较有显著性差异(P<0.05)，而对照组胞浆染色呈阴性。 5、心肌特异性肌钙蛋白I的细胞免疫荧光检测发现诱导12d的细胞染色呈阳性，阳性率为41.8％，与对照组(1.2％)比较有显著性差异(P<0.05)，胞浆发出强烈的绿色荧光，可见心肌细胞特征性横纹结构，而对照组胞浆染色呈阴性。 6、在第12d跳动的心肌细胞群中，可见心肌细胞特征性基因Anf、β-MHC表达。 结论： 1、胎盘中存在着丰富的干细胞，不仅来源广泛，且对其研究不会涉及伦理道德和法律问题，为人类提供了新的干细胞种子来源。 2、利用“悬滴-贴壁”培养法可诱导胎盘来源的干细胞向心肌细胞分化，被诱导分化成有节律性跳动的心肌细胞群，且均不同程度表达各种心肌细胞特征性基因和心肌蛋白。 总之，采用“悬滴-贴壁”培养法将胎盘来源的干细胞诱导分化成节律性跳动的心肌细胞群，并且胎盘干细胞的提取对胎儿与母体均不产生损伤作用，对其研究不会涉及伦理法律问题，且来源广泛，可以作为再生医学中干细胞的一种新的来源。

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实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述心肌再生医学的研究新进展

在学期间科研成绩

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