实验兔VX2肿瘤和转移淋巴结SonoVue超声造影与血管生成比较研究

摘要

转移是影响恶性肿瘤患者预后的重要因素之一。淋巴转移的识别和显示技术成为肿瘤转移的诊断、治疗以及肿瘤.宿主免疫作用机制研究的一个窗口，通过阻断或干预肿瘤新生淋巴管的细胞生长因子的表达，有望达到阻止肿瘤细胞淋巴转移的目的。由微观结构改变导致的淋巴结结构和功能的相应改变，也是影像学研究的热点之一。由于恶性肿瘤本身没有与身体正常循环系统直接联系的通道，必须通过血管生成诱导邻近血管向肿瘤发出新的血管即肿瘤新生血管才可以持续生长。因此，我们的研究假设肿瘤淋巴结转移引起或产生淋巴结自身血管结构的改变，通过经静脉超声造影技术，希望能够显示这种淋巴结内部的微血管改变，进而对淋巴结的功能和结构状况进行全面的评价，确定淋巴结有无转移。
　　 本实验对兔后腿肌肉软组织VX2肿瘤及其转移淋巴结进行SonoVue超声造影显像，研究肿瘤和转移淋巴结微血管灌注模式，并与肿瘤和淋巴结新生血管分布的病理特点对照，分析超声造影的血管灌注特点与微血管分布的关系，探讨SonoVue超声造影显像对肿瘤及淋巴结转移的诊断价值。
　　 论文一：
　　 方法：
　　 成年的大耳白兔16只，体重2.0～2.8 kg。16只为实验组，随机分为4组，每组4只，每只兔双侧后腿肌肉内种植VX2肿瘤组织悬液1ml。荷瘤兔(Tumorbearing rabbits)由中国医科大学医学影像研究所惠赠，VX2肿瘤原系来自同济医科大学。种植肿瘤后第14d、21d、28d、35d进行普通超声和造影超声检查。
　　 超声检查应用德国西门子Sequoia-512彩色多普勒超声显像仪，线阵探头15L8Ws，频率7～12MHz，配备专用小器官超声造影软件。采用Bracco公司声诺维(SonoVue)超声造影剂，造影微泡为磷脂包裹的六氟化硫。实验兔肌肉注射速眠新(0.1～0.2ml/Kg体重)，麻醉后仰卧固定于实验台上，剪掉并剔除兔后腿内侧、胭窝、腹股沟区、下腹部的兔毛，以便超声观察。普通超声检查后选择肿瘤最大切面，采用低机械指数相干脉冲系列成像(Coherent pulse sequences，CPS)造影及组织优化技术(tissue equalization technique，TEQ)，选择FR200帧/秒，触发时间AT=125ms。兔耳缘静脉建立静脉通路，弹丸式注入SonoVue造影剂稀释液0.3ml，并迅速跟进生理盐水5ml。记时并动态存储超声造影图像。造影结束后回放造影增强过程，由3名超声医师对造影增强模式进行分析和描述，并应用ACQ软件进行时间一强度曲线分析，感兴趣区的放置选择肿瘤增强区。避开邻近较大血管。测定3次取平均值。测得肿瘤不同部位开始增强时间(Arrival Time，AT)、达峰时间(Time To Peak，TTP)、峰值强度(Peak Intensity，PI)。所有测量参数以(-x±s)表示。
　　 实验结束空气栓塞处死实验兔，切除VX2肿瘤，标本放入中性福尔马林溶液固定24小时后，石蜡包埋。进行常规HE染色和S-P免疫组化法检测CD34染色阳性细胞，所有染色均进行抗原修复。CD34阳性细胞表现为棕黄或棕褐色颗粒，表达于血管的内皮细胞胞浆，以阳性着色的单个内皮细胞或内皮细胞簇为阳性微血管。
　　 论文二：
　　 健康成年的大耳白兔24只，随机分成两组。实验组16只，对照组8只。实验组首先复制VX2肿瘤荷瘤兔模型，每只兔双侧后腿肌肉内种植VX2肿瘤组织悬液1ml，种植肿瘤后分别于第3，4，5，6周超声造影观察兔胭窝及髂淋巴结转移情况。对照组淋巴结反应性增生模型兔采用两侧胁腹部皮下接种蛋黄悬液，第1周和2周后各注射1次，第3周开始进行淋巴结造影。
　　 超声检查应用德国西门子Sequoia-512彩色多普勒超声显像仪，15L8Ws线阵探头，频率7～12MHz，配备专用小器官超声造影软件。采用Bracco公司声诺维(SonoVue)超声造影剂，造影微泡为磷脂包裹的六氟化硫。实验兔肌肉注射速眠新(0.1～0.2ml/Kg体重)，麻醉后仰卧固定于实验台上，剪掉并剔除兔后腿内侧、腘窝、腹股沟区、下腹部的兔毛，以便超声观察。普通超声检查后选择肿瘤最大切面，采用低机械指数CPS超声造影及TEQ技术，选择FR=200，触发时间△T=125ms。兔耳缘静脉建立静脉通路，弹丸式注入SonoVue造影剂稀释液0.3ml，并迅速跟进生理盐水5ml。记时并动态存储超声造影图像。造影结束后回放造影增强过程，由3名超声医师对造影增强模式进行分析和描述，并应用ACQ软件进行时间一强度曲线分析，感兴趣区的放置选择整个淋巴结，避开邻近较大血管。测定3次取平均值。测得造影开始增强时间(Arrival Time，AT)、达峰时间(TimeTo Peak，TTP)、峰值强度(Peak Intensity，PI)。所有测量参数以(-x±s)表示。
　　 实验结束空气栓塞处死实验兔，切取造影观察的淋巴结，沿淋巴结长轴剖开，中性福尔马林溶液固定24小时后，石蜡包埋。常规HE染色。S-P免疫组化法检测CD34染色阳性细胞，所有染色均进行抗原修复。
　　 采用SPSS13.0软件进行统计分析。实验组和对照组造影增强时间曲线参数值用(-x±s)表示。两组淋巴结大小和两组间造影参数的比较采用q检验；造影结果与淋巴结性质的相关性比较采用Logistic回归分析，p值<0.05认为有统计学意义。
　　 论文一：
　　 实验结果：
　　 1、VX2肿瘤种植后，4只实验兔死亡，其余12只肿瘤种植成功，共38个瘤体，多发9只，单发3只。二维超声表现为低回声，坏死后内部出现不规则无回声。CDFI和CDE显示肿瘤周边型分布条状或点状血流信号。
　　 2、超声造影结果：肿瘤增强模式表现为从周边开始增强向内部不同程度增强，13～20秒肿瘤增强明显，以后减弱，40秒左右排出。内部坏死区无增强。ACQ曲线形态分析：肿瘤边缘增强区缓慢增强，峰顶圆钝，下降支平均持续40秒左右，缓慢排除造影剂；内部无增强区与本底强度一致，呈平直线状。
　　 3、病理结果显示横纹肌组织内可见VX2肿瘤细胞呈巢状或弥漫分布，瘤巢间含有大量不成熟的毛细血管和丰富的纤维组织。CD34免疫组化显示阳性染色的内皮细胞位于VX2肿瘤细胞旁和纤维间质内。
　　 4、免疫组化结果与超声造影增强模式对照：超声造影显示VX2肿瘤组织表现单一增强模式，动脉期快速灌注，一过性增强；肿瘤增强起于周边部，内部不能达到完全增强。CD34免疫组化结果显示，种植于横纹肌组织内的肿瘤组织在邻近血管处显示新生血管存在；在肿瘤组织周围可见新生血管分布，但不能形成正常管腔结构，仅显示为散在或聚集成簇的阳性染色区。肿瘤中央存在灶性坏死，该处未见CD34染色阳性细胞。肿瘤增强模式与CD34染色阳性区的血管分布一致。
　　 论文二：
　　 1、实验组兔死亡4只。实验组发现淋巴结38个，转移淋巴结共28个，占实验组淋巴结总数的73.7％。每只兔均有1个或以上转移淋巴结；对照组淋巴结16个，病理均无转移。
　　 2、实验组和对照组淋巴结短径在两组间差别显著(P<0.05)，普通超声显示转移淋巴结淋巴门不清晰或消失，淋巴结内部回声不均质；髂淋巴结可显示并有融合。对照组和未转移淋巴结显示胭窝淋巴结可见淋巴门，未见淋巴结融合及髂淋巴结显示。
　　 3、超声造影显示转移淋巴结表现为边缘型增强或内部不均匀增强，未转移淋巴结全部表现为中央开始的弥漫均匀增强。良恶性淋巴结造影增强时间一强度曲线分析比较结果显示，恶性组达峰时间(9.76±1.90秒)与良性组(15.44±3.71秒)，差异显著(P<0.05)。超声造影诊断淋巴结转移的特异度72.7%，阳性预测值84.2%。与普通超声结果比较(特异度57.1%，阳性预测值73.7%)，特异度和阳性预测值增加。
　　 4、病理显示转移淋巴结肿瘤细胞破坏淋巴结正常结构，肿瘤转移区CD34阳性血管内皮细胞表达增多；肿瘤细胞侵犯的淋巴结内部局灶性坏死区，未见CD34阳性染色血管内皮细胞分布。反应性增生淋巴结保持原有结构和血管分布，CD34染色阳性细胞在反应性增生淋巴结未见显示。
　　 结论：
　　 1、SonoVue低机械指数超声造影是一种敏感而安全的评价肿瘤血管生成的检查方法，兔VX2软组织肿瘤淋巴结转移模型可以用于评价淋巴结转移的超声和病理改变。
　　 2、超声造影增强模式可以反映实验兔VX2软组织肿瘤和淋巴结的血管灌注特点。肿瘤血管生成的分布特点是兔VX2软组织肿瘤和转移淋巴结超声造影增强模式的病理基础。
　　 3、淋巴结超声造影增强模式的差别，可以反映淋巴结新生血管内皮细胞的分布的差别，提示血管分布改变。淋巴结超声造影增强模式可以用于鉴别淋巴结的良恶性。