系统性红斑狼疮患者血中NKT细胞的变化及意义

摘要

前言：系统性红斑狼疮(SLE)是一种临床表现有多系统损害症状的慢性系统性自身免疫病，其血清存在抗核抗体、高γ球蛋白血症、免疫复合物的形成和补体系统的激活，具有难治性、易复发性、致死率高等特点，其重要临床特征为多种自身抗体及免疫复合物形成，B淋巴细胞高度活化和多种细胞因子水平异常。
　　 NKT细胞是在免疫系统中新发现的一类淋巴细胞，它是一群独立的免疫细胞，具有特定的细胞表面标志，不同于T、B淋巴细胞以及NK细胞，是一个具有自然杀伤细胞(NK)受体及功能的T细胞亚群，NKT细胞不仅表达T细胞的表面标志，而且表达NK细胞的表面标志，并且在不同刺激下分泌大量具有免疫调节作用的细胞因子，如IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α等，影响免疫反应的类型，使免疫反应向Th1型或Th2型转换。SLE患者血中细胞因子的异常变化与T、B淋巴细胞的过度增殖有关，Th1/Th2的失衡可能在该病的免疫调控过程中发挥了重要作用。
　　 目前NKT细胞的研究大部分限于小鼠，人类的NKT细胞的研究较少，NKT细胞在免疫反应中显示多方面作用，从目前的研究来看，此类细胞的免疫调节功效超过其效应功能，除了凸显于自身免疫病外，在肿瘤及骨髓移植等实验中都有同样的表现。在一系列不同的人类自身免疫疾病中，包括1型糖尿病和多发性硬化症发病的高峰期往往伴有NKT细胞数目和活性的降低，提示NKT细胞的功能低下可使自身反应性T细胞的功能相对亢进而致使发病机率增加。
　　 本实验通过对SLE患者及健康人外周血NKT细胞的数量变化的研究进一步了解其在发病中的作用，由于人外周血中NKT细胞数量极少，给深入了解NKT细胞功能带来阻碍，本实验利用NKT细胞可以被其相应配体α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)激活的特性，进行体外增殖进一步研究NKT细胞及其分泌细胞因子在SLE发病中的作用，探讨SLE患者NKT细胞分泌的细胞因子的类型(Th1/Th2)及作用。
　　 许多研究者发现SLE患者及动物模型体内存在着细胞因子的网络失调。SLE发病机制中Th细胞亚群失衡的观点就是根据细胞因子谱偏移的现象提出来的。Th细胞按其分泌细胞因子不同而分为Th1和Th2两亚群，前者分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α，后者分泌IL4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，正常时两者维持一定平衡，一旦失衡则可能导致疾病。
　　 对于NKT细胞调节SLE的作用，曾经发现Va14+NKT细胞在SLE易感小鼠中随着年龄增加而逐渐减少，并且NKT细胞数量的减少先于疾病的进展。而在SLE病人中NKT细胞的数量变化及其在该病中所起的作用还不清楚，由此可见，对SLE患者血中NKT细胞的研究已成为一个新的靶点。本实验通过体内、体外应用不同干预因素对SLE患者NKT细胞数量及功能影响的研究，明确不同干预因素对NKT细胞数量的变化，为SLE患者治疗寻求一条新的途径。
　　 实验方法
　　 第一部分：选择SLE患者30例及正常对照者30例，空腹采集外周静脉肝素抗凝血，取100μl加入TCRVα-24FITC、TCR Vβ11-PE和CD161-PE各20μl，4℃避光孵育30min，加入红细胞裂解液，应用流式细胞术检测SLE及正常对照者血中NKT细胞占淋巴细胞比率。
　　 第二部分：将SLE患者10例及正常对照者10例，静脉血中分离的单个核细胞(PBMC)一部分培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640中，加入含有GM-CSF，IL-4完全培养液培养5d后，制备并纯化DC；另一部分加在12孔培养板中37℃，5％CO2及饱和湿度的条件下培养5d，分成4组：对照组、a-Galcer组、DC组、a-Galcer+DC组，每实验孔加入1.5×106细胞，培养14天后收集各组培养板中的细胞做流式细胞检测。选择细胞增殖多的a-Galcer+DC组进行NKT纯化后测定细胞内细胞因子IL-4，IL-10、IFN-γ和TNF-α的阳性比率。
　　 第三部分：选择SLE患者30例随机分为两组：A组15人，B组15人。分别于用药前及用药24h后清晨空腹采集静脉肝素抗凝血。A组应用甲强龙40mg静脉点滴，B组应用甲强龙(40mg)加丙种球蛋白(10g)静脉点滴，24h后用流式细胞术检测NKT细胞数量。同时将用药前静脉血制备PBMC，A组加甲强龙8ug/ml；B组分两部分：一部分加甲强龙8ug/ml+丙球2mg/ml，另一部分加细胞因子IL-12+IL-18各40ng/ml，培养48h后检测NKT细胞占淋巴细胞比率。
　　 实验结果
　　 第一部分：SLE患者外周血Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT细胞显著低于正常对照组(p<0.05)，Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT细胞与C3，C4呈正相关关系(r=0.665，r=0.650，r=0.635，r=0.624，P<0.01)，与SLEDIA及ESR呈负相关关系(r=-0.678，r=-0.424，r=-0.652，r=-0.433，P<0.01，P<0.05)。
　　 第二部分：以TCRVα24Vβ11标记NKT细胞，扩增前，PBMC中Vα24NKT细胞百分含量较低，仅为(1.01±0.59)％，a-Galcer组、DC组、a-Galcer+DC组分别培养14天后，三组中Vα24NKT细胞百分含量和细胞数均有不同程度的增多，a-Galcer+DC组的扩增效果最好，DC组次之，其中，a-Galcer+DC组细胞扩增细胞数明显增加，Vα24+Bβ11+NKT细胞占总淋巴细胞的(26.63±11.03)％，较扩增前增长了(13.15×102)倍。
　　 比较三种培养方法后，选择α-GalCer+DC组培养方法进行细胞扩增，测定细胞内细胞因子，SLE患者外周血Vα24+Vβ11+NKT在佛波酯和离子霉素的强刺激下，Vα24+Vβ11+NKT细胞能快速分泌大量的IL-4(43.16±22.38)、IL-10(32.12±21.33)、IFN-γ(29.87±18.69)、TNF-α(19.78±10.12)，正常人外周血Vα24+Vβ11+NKT在佛波酯和离子霉素的强刺激下，分泌IL-4(24.10±18.25)，IL-10(24.25±17.36)，和IFN-γ(35.38±14.59)，TNF-α(36.93±18.62)。
　　 第三部分：SLE患者体内应用甲强龙及甲强龙加丙球24h后Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率明显高于用药前(P<0.01)，SLE患者体外制备PBMC后加甲强龙、甲强龙加丙球及IL-12+IL-18进行细胞培养48小时后，Vα24+Vβ11+NKT，CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率明显高于用药前(P<0.01)；体外应用IL-12+IL-18与体外应用甲强龙及甲强龙加丙球，Vα24+Vβ11+NKT，CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率无明显差异(P>0.05)。
　　 结论：
　　 第一部分：SLE患者外周血Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率显著低于正常对照组，表明Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT细胞可能参与SLE的发病过程；
　　 SLE患者Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT细胞与补体C3，C4呈正相关关系，与SLEDIA及ESR呈负相关关系，表明Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率的减少可能与病情活动有关；CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率显著低于正常对照组，表明活化的NKT细胞占淋巴细胞比率减少可能与SLE的发病有关。
　　 第二部分：α-GalCer，DC组，α-GalCer+DC组中，α-GalCer-DC组体外Vα24+Vβ11+NKT细胞扩增数量最多。
　　 SLE患者Vα24+Vβ11+NKT细胞分泌IL-4及IL-10阳性比率高于IFN-γ和TNF-α，高于健康对照组(P<0.05)，健康对照组IFN-γ及TNF-α阳性比率高于IL-4及IL-10；说明SLE患者NKT细胞分泌的细胞因子以Th2型细胞分泌的细胞因子为主，而健康人NKT细胞分泌的细胞因子以Th1型细胞因子为主。
　　 第三部分：体内外应用甲强龙及甲强龙加丙球后，Vα24+Vβ11+NKT，CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率明显高于用药前；
　　 体内甲强龙及甲强龙加丙球组分别低于相应的体外组，且有统计学差异，可能是体外实验偏倚所致；
　　 体外加IL-12+IL-18后与用药前比，Vα24+Vβ11+NKT，CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率明显高于用药前；与体外应用甲强龙及甲强龙加丙球相比，Vα24+Vβ11、CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率无明显差异，表明细胞因子IL-12+IL-18可能成为治疗SLE的一种新的方法。