丙型肝炎病毒核心蛋白编码基因鉴定与表达研究

摘要

目的：在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心(core，C)蛋白，为HCV C蛋白功能研究奠定基础。 方法：1.中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞购于中国科学研究院上海细胞库。含HCV C基因全长体系重组质粒pCMH6K由冯国和构建，感受态菌DH5α购自Takara公司。质粒小剂量提取试剂盒(Takara，product No． DV801A)、限制性内切酶BamH1购于Takara公司；脂质体(lipofectamine2000)购于invitrogen公司；氨苄青霉素购自Sigma公司；琼脂糖购自Takara公司；细胞培养基D—MEM(Dulbecos modifiedeagle medium)，10％胎牛血清(fatal calf serum，FCS)，青、链霉素均购于海科隆公司。山羊抗鼠IgG1购于Santa公司，FITC标记免抗山羊CD32购自北京中杉公司．2.从—80℃冰箱中取出冻存的感受态细胞，冰上解冻并转化pCMH6K，参照Takara试剂盒说明书，小剂量提取pCMH6K并经BamH1酶切电泳鉴定。采用脂质体转染技术通过Lipofectamine2000介导瞬时转染pCMH6K于CHO细胞。用无血清无抗生素的DMEM洗细胞2次，加入脂质体/质粒混合物于六孔板，加入无血清的D—MEM并于37℃，5％CO2的条件下常规培养6h，更换含有10％FCS的D—MEM继续72h。3.免疫荧光检测：6孔板常规培养pCMH6K转染的CHO细胞，待细胞密度达到70％时，4％的多聚甲醛固定1h；0.1％的Triton溶液打孔10min；0.1％BSA封闭1h；山羊抗鼠IgG1(0.1％BSA稀释，稀释度1:100)，4℃孵育过夜；暗室中加入荧光二抗(0.1％BSA稀释，稀释度1:100)37℃孵育1h；每次5min，50％甘油封片后于荧光显微境下观察细胞并拍照。 结果：所克隆的HCV C蛋白编码基因经酶切、电泳分析为573bp；pCMH6K转染的CHO细胞胞浆及胞膜可见绿色荧光表达。 结论：转化的pCMH6K经酶切、电泳鉴定含有HCV C蛋白编码基因；pCMH6K转染的CHO细胞可表达HCV C蛋白，主要表达在胞浆与胞膜。

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综述 丙型肝炎病毒核心蛋白作用研究进展

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