脓素症内皮细胞凝血功能障碍与p38MAPK/NF-κB传导通路的关系及其作用机制的研究

摘要

前言
　　脓毒症是严重全身感染引起的炎症反应过度激活及凝血机能障碍。而内皮细胞(endothelialcell，EC)是凝血启动和炎症反应激活过程中最重要的效应细胞，因此，EC活化和功能障碍是脓毒症发展恶化的中心环节。
　　组织因子(TF)是外源性凝血途径的启动因子，单核细胞、平滑肌细胞及内皮细胞等多种炎性细胞能表达TF。正常情况下，TF在直接接触血液的EC中表达量很低，在多种致炎刺激时，EC表达TF显著增加，从而可能在脓毒症情况下，启动TF介导的凝血激活。血管性假性血友病因子(vonWillebrandfactor，vWF)由血管内皮细胞或巨核细胞合成。当血管内皮细胞受损时，可致vWF等内容物释放入血增多，因此vWF是反映内皮细胞受损的重要标记物，其水平高低可反映血管内皮受损严重程度，并可作为治疗、判定预后的一项评价指标。在脓毒症时肿瘤坏死因子(TNF-α)分泌显著地增多，被认为是介导感染性休克损伤的首要介质，起着扳机样关键作用。
　　在炎症介质表达调控中，核因子-κB(NF-κB)激活和核移位是关键的一步。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogenactivatedproteinkinaseMAPK)是MAPK家族成员之一，在肿瘤的发生、应激反应、炎症、缺血再灌注损伤及免疫调控等领域发挥着重要作用。信号转导通路是凝血与炎症相互影响的病理生理基础。已有研究证实通过p38MAPK/NF-κB通路可使脓毒症诱导的心肌细胞进入炎症表型。探讨对凝血和炎性反应都具有重要意义的信号转导机制，可能面临广阔的应用前景，成为一条新的治疗脓毒症的途径。
　　凋亡是脓毒症的中心特征。细胞凋亡的调控是一种复杂的多水平的调控，多种因素相互作用促进或抑制凋亡的发生。多项实验都表明在内毒素所致的心肌损伤和肝损伤等脏器损伤中凋亡显著增加。p38MAPK和NF-κB与凋亡关系密切。肝素是实用性最强、最便宜、最常用的抗凝药物。除具有抗凝、抗血栓形成的作用外，还具有多种效应。
　　实验方法
　　1、ELISA方法检测脓毒症病人和健康对照者血中的TF、vWF和TNF-α
　　应用ELISA试剂盒检测。每个标本做三孔检测。
　　2、内皮细胞培养与传代
　　脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于含20％胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃，5％CO2培养箱中培养。用0.125％胰蛋白酶（含0.01％EDTA）消化。
　　3、实验分组
　　分为阴性对照组:正常人血浆;阳性对照组:TNF-α20ng/ml;实验组:不同浓度的脓毒症病人血浆;拮抗剂组:SB239063（p38MAPK的拮抗剂），PDTC(NF-κB的拮抗剂)，U0126（ERK1/2的拮抗剂）+脓毒症病人血浆;肝素组:不同浓度的肝素。
　　4、检测脓毒症血浆刺激HUVEC上清液中TF、vWF的表达
　　将制成的细胞悬液调整细胞数为5×105/ml，种植于24孔板中，在培养箱中培养36-48小时后，细胞已贴壁融合。换用无酚红无血清的DMEM培养液培养24小时，使细胞同步于G0期。按阴性对照组，实验组和拮抗剂组加入不同的刺激因素。应用ELISA试剂盒检测。每个标本做三孔检测。
　　5、Westernblot法检测MAPK亚基及NF-κB蛋白表达的变化
　　提取细胞蛋白质，测量待测样本A650值，蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印迹法，蛋白印迹的分析。
　　6、免疫荧光方法检测内皮细胞中p38MAPK和NF-κB的表达
　　将细胞悬液滴在铺有凝胶的盖玻片上，在培养箱中培养24-36h。加入不同的刺激因素，并经过固定，打孔，封闭，加入一抗，二抗等步骤，最后在荧光显微镜下观察。
　　7、HUVEC凋亡的检测
　　实验组加入10％脓毒症血浆;拮抗剂组加入SB23906325μM，PDTC200μM作用1h后，再加入10％脓毒症血浆;肝素组加入肝素20U/ml作用1h后，再加入10％脓毒症血浆;作用3h，6h，12h，18h。用0.125％胰蛋白酶（不含EDTA）消化HUVEC，制成细胞悬液。应用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒，在流式细胞仪上检测。
　　实验结果
　　一、脓毒症病人TF，vWF和TNF-α的检测结果
　　1、TF，vWF和TNF-α在脓毒症病人和正常人血中的含量
　　分别检测凝血活性指标TF，内皮损伤指标vWF以及炎症介质TNF-α，结果显示脓毒症病人组明显高于正常人组(P=0.00)。
　　2、TF，vWF和TNF-α在脓毒症死亡病人和存活病人间的比较
　　分别比较了16名存活病人和8名死亡病人的TF，vWF和TNF-α，发现TF，TNF-α在两组病人中的差别有显著性，vWF在两组病人间无差别。
　　3、不同APACHEⅡ评分的脓毒症病人中TF，vWF和TNF-α
　　16分以上病人的TF和TNF-α值与8-10分相比均有统计学意义。APACHEⅡ评分较高病人（21分以上）的vWF与8-10分相比才有统计学意义。
　　4、脓毒症病人中TF，vWF和TNF-α之间的相关性
　　TF和TNF-α之间有明显的相关性(r=0.696，p＜0.01)，TF和vWF之间，vWF和TNF-α之间有较弱的相关性（r=0.531，p＜0.05和r=0.442，p＜0.05）。
　　二、脓毒症病人血浆对培养内皮细胞TF、vWF产生和p38MAPK、NF-kB途径的影响
　　1、脓毒症血浆对内皮细胞TF、vWF产生的影响
　　vWF在120min达到高峰，随之下降;TF在180min最高。10％、20％、30％脓毒症病人血浆刺激HUVEC均可引起vWF和TF的升高。在一定范围和时间内，vWF和TF的升高与sepsis血浆呈时间，剂量依赖关系。
　　2、检测脓毒症血浆刺激HUVEC后p-p38，p-ERK1/2的表达
　　Westernblot检测结果表明磷酸化p38，磷酸化ERK1/2在各时间点均有不同程度的表达，30min的磷酸化p38表达最明显。
　　3、脓毒症血浆刺激后，HUVECp38，NF-kB的表达
　　用ELISA方法和免疫荧光两种方法进行检测。证实p38，NF-kB参与脓毒症的内皮损伤和凝血功能障碍。
　　4、p38MAPK对HUVECNF-κB活化的影响
　　用20％脓毒症血浆刺激HUVEC，可以看到2minp38开始活化，5minNF-κB活化，加入p38拮抗剂SB239063后，NF-κB活化受阻。
　　三、脓毒症血浆和肝素对内皮细胞凋亡的影响
　　1、脓毒症血浆作用6h对HUVEC凋亡的影响
　　脓毒症血浆作用6h未引起HUVEC凋亡的增加。
　　2、不同因素作用12h对HUVEC凋亡的影响
　　10％脓毒症血浆作用12h可引起细胞凋亡增加。p38MAPK和肝素促进细胞凋亡，NF-κB抑制细胞凋亡。
　　3、不同因素作用18h对HUVEC凋亡的影响
　　10％脓毒症血浆作用18h可引起细胞凋亡增加，程度大于12h。p38MAPK和肝素促进细胞凋亡，NF-κB抑制细胞凋亡。
　　结论
　　1、脓毒症病人血中TF，vWF和TNF-α的含量明显增高。
　　2、脓毒症血浆通过p38MAPK/NF-κB传导通路引起凝血功能障碍。
　　3、脓毒症血浆引起细胞凋亡增加。p38MAPK和肝素促进凋亡，NF-κB抑制凋亡。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 脓毒症病人血中组织因子、血管性假性血友病因子与肿瘤坏死因子-α的检测

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 p38 MAPK／NF-κB传导通路在脓毒症诱导的内皮细胞损伤和凝血功能障碍中的作用

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 P38MAPK，NF-κB途径对脓毒症血浆刺激的内皮细胞凋亡的影响及肝素的干预作用

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 p38 MAPK，NF-κB和肝素与脓毒症内皮细胞损伤

致谢

个人简介