酿酒酵母单一亚单位NADH-泛醌氧化还原酶活性中心的初步解析

摘要

目的：哺乳动物线粒体呼吸链复合体Ⅰ催化电子从NADH向泛醌(ubiquinone，UO或Q)的转运，同时伴随能量的生成，它是哺乳动物呼吸链内唯一的NADH-泛醌氧化还原酶，复合体Ⅰ对鱼藤酮敏感。与其相反，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)线粒体具有另一种NADH-泛醌氧化还原酶--2型NADH-泛醌氧化还原酶(typeⅡ NADH-ubiquinone oxidoreductase，NDH-2)，缺乏复合体Ⅰ，NDH-2对鱼藤酮不敏感，不泵质子，是NADH-泛醌氧化还原酶中结构最简单的酶，由单一多肽组成，非共价结合FAD为辅基，无Fe-S簇。酿酒酵母线粒体中存在两种NDH-2，一种面向线粒体基质，催化基质内NADH的氧化，称为内NADH脱氢酶(internal NADH dehydrogenase，Ndi)，另一种面向线粒体膜间腔，催化胞质侧的NADH氧化，称为外NADH脱氢酶(external NADH dehydrogenase，Nde)。Ndi仅有一种，命名为Ndi1(the single subunit NADH-ubiquinone oxidoreductase，单一亚单位NADH-泛醌氧化还原酶)，Nde分两种，命名为Nde1、Nde2。Ndi1在催化基质内NADH氧化的作用方式上与复合体Ⅰ相似。一系列研究显示，在大肠杆菌中表达的Ndi1可作为呼吸链的一个成员发挥作用。另外，在细菌、植物和真菌的线粒体中Ndi1和复合体Ⅰ可以共存。近来研究发现，酿酒酵母Ndi1可以作为由于复合体Ⅰ缺陷所致线粒体疾病的治疗方法之一，在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)所致帕金森病鼠模型上，脑黑质中表达的Ndi1具有保护作用，可能由于Ndi1补充了复合体Ⅰ缺陷所造成的电子从NADH向Q的传递障碍，降低活性氧产生。但迄今为止，生化学上关于酿酒酵母Ndi1的研究报道还很少。
　　 酿酒酵母Ndi1催化电子从NADH向泛醌的传递。呼吸链的组成成分--砭醌为脂溶性醌类化合物，既可以结合到线粒体内膜上，也可以游离状态存在。它以不同的形式在电子传递链中起传递电子的作用。泛醌不仅接受NADH-Q氧化还原酶脱下的电子和氢原子，还接受线粒体其他黄素酶脱下的电子和氢原子，是呼吸链复合体之间电子传递的枢纽。因此，对泛醌结合部位进行解析是理解呼吸链酶功能不可缺少的。
　　 定点突变方法是研究蛋白质结构和功能关系的常用手段之一，常被用来探究某特定氨基酸在蛋白质生物功能中的作用。Fisher和Rich推测含8-9个残基的F/A/L-X(3)-H-X(2-3)-T/L/S序列为泛醌结合序列，所有序列的中央位置均为组氨酸(His)，因此His可能在与泛醌环相互作用上起重要作用。酿酒酵母Ndi1有11个His残基，我们了选择了其中3个与该序列相似性相对高的His残基(193、252、301)构建突变体，突变体分别命名为H193A、H252A、H301A。同时，根据氨基酸序列相似性分析，对酿酒酵母Ndi1中保守性相对较高的4个部位氨基酸残基(L93、L195、E242、D383)进行突变。采用定点突变方法初步对电子传递过程中Ndi1的泛醌结合部位进行解析。
　　 酿酒酵母Ndi1酶催化电子从NADH向Q的传递，同时生成NAD+和泛醇(ubiquinol，UQH2)，有研究显示该反应机制可能为pingpong-bibi机制。但酿酒酵母Ndi1两底物在酶活性中心的结合位置关系至今未明。本研究通过观察抑制剂泛醇、活性蓝-2(reactive blue-2，RB-2)对酿酒酵母Ndi1酶的抑制类型间接解析底物在活性中心的结合位置关系。同时观察蛋白酶K水解酿酒酵母Ndi1产物实验初步对电子传递过程中酿酒酵母Ndi1酶构象变化作一探讨。
　　 方法：
　　 1、快速PCR定点突变方法构建酿酒酵母NDI1突变质粒根据设计的定位点突变要求设计引物，制备分别具有以下突变位点的质粒L93A、H193A、L195A、L195I、E242D、H252A、H301A、D383Q。以质粒pPCR-ScriptAmp SK(+)-NDI1为模板，加入Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增产物经DpnⅠ限制性内切酶消化后，转化感受态细胞E.coli；DH5α，将转化后的E.coli DH5α均匀涂布于含Amp的2×YT平板(Amp浓度为100μg/ml)，37℃倒置培养14～16 h。挑取转化的阳性克隆于含Amp的2×YT培养液中培养过夜，提取质粒。经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切、1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物、DNA测序鉴定突变结果。
　　 2、酿酒酵母Ndi1及其突变体在大肠杆菌中的表达纯化野生型及突变pPCR-Script Amp SK(+)-NDI1质粒经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切后，与经同样双酶切的pET-16b连接，构建表达质粒pET-16b-NDI1，转化感受态细胞E.coli DH5α后，经双酶切、DNA测序确认突变。将表达质粒pET-16b-NDI1转化E.coli BL21(DE3)pLysS，在5 ml含Amp2×YT培养液中，37℃，225 rpm小量培养后，接种于500 ml摇瓶中大量培养至OD600达0.8，加入IPTG终浓度为1mM，30℃，70-80 rpm诱导表达10 h、离心收集并洗涤菌体，2次冻融后超声破菌、超离心后收获膜。膜在50 mM Tris-HCl(pH8.0，4℃)、200 mM NaCl、0.1 mMEDTA、10％glycerol、1 mM PMSF中可溶化后，以0.3％(W/V)Triton X-100抽提，经Ni-NTA柱纯化、脱盐、浓缩后获得His标记的成熟Ndi1酶及各突变体蛋白，液氮冷冻后，-80℃保存。
　　 3、酿酒酵母Ndi1及其突变体的酶动力学分析NADH-UQ1氧化还原酶活性通过测定30℃，340 nm处NADH氧化吸收光谱计算获得(NADH在340 nm消光系数ε=6.2 mM-1cm-1)。反应体系(0.5 ml)包括50 mM NaH2PO4(pn6.0)、1 mM EDTA、NADH、UQ1和酶。分别测定不同底物浓度下的酶促反应的初速度v0，以1/v对1/[S]作图，即Lineweaver-Burk双倒数法，从直线的截距求得该反应条件下Ndi1酶及突变体催化反应的米氏常数Km和最大反应速度Vmax。
　　 4、抑制剂UQH2、RB-2的对酶的抑制类型在酶动力学参数测定反应体系中，改变抑制剂浓度(抑制剂UQH2浓度为0μM、30μM、60μM、100μM；RB-2浓度为0 nM、15 nM、30 nM、45 nM、60 nM)，测定不同浓度对酶活性的影响，以Lineweaver-Burk双倒数作图，判断UQH2、RB-2对酶的抑制类型。
　　 5、蛋白酶K水解实验在不同还原剂或NAD+存在条件下，以蛋白酶K消化Ndi1酶1 h、2 h、3 h后，消化后产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
　　 结果：
　　 1、质粒酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示NdeⅠ/XhoⅠ双酶切产物在3 kb和1.5 kb处出现特异性条带，与预期片段大小相符(质粒pPCR-Script AmpSK(+)为3 kb，NDI1为1.5 kb)。突变部位DNA测序结果显示各位点均发生突变。
　　 2、E.coli BL21(DE3)pLysS中表达纯化、通过Triton X-100获取的His标记成熟酿酒酵母Ndi1酶，其NADH-UQ1氧化还原酶活性为1120μmol NADH氧化量/min/mg，与之前报道的从酿酒酵母线粒体获取的Ndi1酶活性1670μmol NADH氧化量/min/mg相近。
　　 3、Ndi1酶对UQ1的米氏常Km值为21.0μM，对NADH的米氏常Km值为12.0μM。各突变体动力学参数显示L93A、L195A、L1951、E242D、H301A、D383Q对UQ1的Km明显增大，L93A、H193A、L195A、H252A、H301A、D383对UQ1的Vmax均有明显减小，L93A、L195A、H301A、D383Q在Km增大的同时出现Vmax的减小，导致Vmax/Km值大幅下降。各突变体蛋白对NADH的Km未见明显增大，但Vmax出现明显减小。
　　 4、抑制剂实验结果显示UQH2竞争性抑NUQ1与酶的结合，但不影响NADH与酶的结合；RB-2竞争性抑制NADH与酶的结合，但不影响UQ1的结合。
　　 5、酿酒酵母Ndi1酶经蛋白酶K水解后，产物SDS-PAGE显示，反应中加入NAD+、还原剂NADPH或连二亚硫酸钠，酶消化产物的电泳结果与仅加蛋白酶K的对照组无差异；而加入NADH组，消化产物电泳显示各时间点上小分子片断均较对照组明显增多、大分子片断明显减少，提示NANADH后Ndi1酶分子内部可能发生构象变化。
　　 结论：
　　 1、快速PCR定点突变方法可对酿酒酵母NDI1基因实现定点突变。
　　 2、E.coli BL21(DE3)pLysS中表达纯化的His标记成熟酿酒酵母Ndi1酶与天然Ndi1具有相同酶活性。
　　 3、酿酒酵母Ndi1酶保守性较高的L93、L195、H301、D383参与泛醌的结合位点组成。
　　 4、酿酒酵母Ndi1酶催化NADH-UQ1氧化还原反应时，两底物UQ1与NADH分别结合于酿酒酵母Ndi1酶活性中心的不同部位。