拮抗细菌P-161对温室甘蓝枯萎病的防效及发酵条件的研究

摘要

北京市农林科学院植环所从京郊菜园土壤中分离到一株拮抗细菌，代号P一16l。初步试验证明其有较好的生防潜力。本文从菌株的拮抗性、对甘蓝枯萎病的温室防效、菌株的鉴定、摇瓶发酵培养基筛选、发酵条件优化和发酵液基本理化特性等方面进行了比较系统的研究。主要结论如下。 1．对峙培养结果表明，P-161菌株对供试的甘蓝枯萎病菌等16种植物病原真菌的抑菌带均较明显，抑菌带宽度达6.6mm～12.5mm，说明P-161菌株对这些病原真菌都具有明显的抑制作用。其中P-16l菌株对甘蓝枯萎病菌的抑菌带宽度达8.3mm，辣椒炭疽病菌抑制作用最强，抑菌带宽度达12.5mm；P-161菌株对玉米大斑病菌、小麦纹枯病菌、桃褐腐病菌和茄子早疫病菌的抑菌带都在9.0mm以上，抑菌效果较为理想。温室试验结果表明，P-161菌株对甘蓝枯萎病于12天和20天的防治效果分别为96.25％和74.89％，对甘蓝枯萎病的控制作用是非常有效的，其结果较为理想。 2．根据《伯杰细菌鉴定手册》(第9版，1994)和《微生物分类学》的有关细菌分类鉴定标准，综合分析评价P-161菌株的菌体形态、培养特征、生物学性状及生理生化性质，与芽孢杆菌菌种的检索表及相关特征比较，P-161菌株与枯草芽孢杆菌的主要鉴别特征基本一致，符合枯草芽孢杆菌在分类地位上的基本要求。由此，初步将P-161菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 3．经试验证明，P-161菌株对引起黄瓜、甘蓝和西瓜枯萎病的尖孢镰刀菌的抑制大体上是由竞争作用和拮抗作用所致。其中较为重要的是P-161菌株通过分泌某种拮抗物质造成病原菌孢子萌发受抑制、畸形；菌丝溢缩变细、菌体内涵物泄漏中空甚至彻底崩解。P-161菌株对病原菌的竞争作用是很明显的，它可能在实际控病中起到重要作用。 4．本研究采用均匀设计与正交设计试验，最终明确了P-161菌株最合适的产抗培养基及工业发酵培养基。实验室产抗培养基的配方为：牛肉膏1％，葡萄糖1.3％，蛋白胨1.9％，酵母粉0.2％，NaCl 0.6％；工业发酵培养基的配方为：玉米粉1.2g，豆饼粉3.0g，K<,2>HPO<,4>·3H<,2>O 0.4g。明确了P-161菌株最佳发酵培养条件为：种龄21-24h，接种量5％，初始pH 6，温度35℃，瓶装量50ml/500ml，摇床转速180r/min，发酵周期72h。通过对发酵培养基的筛选及培养条件的优化，相比原始发酵培养基，发酵液抑菌活性及活菌体均有显著的提高。 5．P-161菌株产生的抑菌活性物质在不同光、热、酸、碱环境下的稳定性试验表明，P-161菌株的发酵滤液活性物质在100℃处理60min保持较稳定状态，而在121℃高温情况下处理30min，其活性明显下降；紫外灯照射10min内其活性与对照无明显差异，而照射30min以上时其活性下降明显；在pH 2-6范围内或偏酸性条件下其活性较稳定，在pH 8-12的范围内，发酵滤液活性物质的活性呈明显下降的趋势，说明该抑菌活性物质对碱敏感，即在碱性条件下不稳定。综合评价该代谢产物稳定性良好。

目录

声明

摘要

第一章植物病害生物防治研究进展

1.1植物病害生物防治类型

1.1.1有益微生物的利用

1.1.2微生物代谢产物在病害防治中的应用

1.1.3植物源杀菌剂

1.1.4遗传工程菌

1.2植病生防作用机制

1.2.1抗菌作用

1.2.2竞争作用

1.2.3重寄生作用

1.2.4诱导系统抗性(SAR)

1.3芽孢杆菌在生物防治中的应用

1.3.1芽孢杆菌的特点

1.3.2芽孢杆菌的防病机制

1.3.3芽孢杆菌产生抗菌物质的研究现状

1.4结语

1.5本研究的目的及意义

第二章P-161菌株生防效果的测定

2.1材料与方法

2.1.1供试材料

2.1.2主要仪器设备

2.1.3 P-161抑菌谱的测定

2.1.4 P-161发酵滤液抑菌活性的测定

2.1.5 P-161对甘蓝枯萎病的控制效果评价

2.2结果与分析

2.2.1 P-161抑菌谱的测定

2.2.2 P-161发酵滤液抑菌活性的测定

2.2.3 P-161对甘蓝枯萎病的控制效果评价

2.3结论与讨论

第三章P-161菌株鉴定

3.1材料与方法

3.1.1供试拮抗菌

3.1.2主要仪器设备及化学试剂

3.1.3菌株形态学的观察

3.1.4菌株培养性状的观察

3.1.5生理生化反应

3.2结果与分析

3.2.1拮抗菌株P-161的培养性状观察

3.2.2拮抗菌株P-161的生理生化特性分析

3.2.3拮抗菌株P-161的种类鉴定

3.3结论与讨论

第四章P-161菌株拮抗机理的初步研究

4.1材料与方法

4.1.1供试菌株

4.1.2培养基

4.1.3主要仪器设备

4.1.4 P-161无菌发酵液与菌体悬浮液的制备

4.1.5挥发性代谢物质对Fusarium oxysporum菌丝的拮抗作用

4.1.6发酵滤液抗菌物质对Fusarium oxysporum孢子萌发、菌丝生长的影响

4.1.7 P-161对靶标病原菌的竞争作用

4.1.8拮抗物质浓度与抑菌率的关系

4.2结果与分析

4.2.1挥发性代谢物质对Fusarium oxysporum菌丝的拮抗作用

4.2.2 P-161发酵滤液对靶标病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响

4.2.3 P-161对Fusarium oxysporum的竞争作用

4.2.4拮抗物质浓度与抑菌率的关系

4.3结论与讨论

第五章P-161菌株发酵培养基及发酵条件优化

5.1材料与方法

5.1.1供试菌株

5.1.2培养基

5.1.3培养方法、活菌数及抗菌活性测定

5.1.4实验室产抗培养基的筛选

5.1.5工业发酵培养基的筛选

5.1.6培养条件对P-161菌株生长的影响

5.2结果与分析

5.2.1实验室产抗培养基的筛选

5.2.2工业培养基基本营养物质的筛选

5.2.3采用均匀设计进行工业培养基的筛选

5.2.4采用正交设计确定各因素的主效及一级互作

5.2.5采用均匀设计确定各因素的最佳配比

5.2.6培养条件对P-161菌株生长的影响

5.3结论与讨论

第六章P-161菌株发酵滤液的活性稳定性测定

6.1材料与方法

6.1.1供试菌株

6.1.2培养基及培养条件

6.1.3发酵滤液热稳定性测定

6.1.4发酵滤液光稳定性测定

6.1.5发酵滤液酸碱稳定性测定

6.2结果与分析

6.2.1发酵滤液热稳定性测定

6.2.2发酵滤液光稳定性测定

6.2.3发酵滤液酸碱稳定性测定

6.3结论与讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文