白喉毒素无毒突变体CRM197介导大分子物质通过血脑屏障效果和机制的研究

摘要

目的：
　　 血脑屏障的存在极大的限制了大分子药物通过血脑屏障进入脑组织,如何转运大分子药物通过血脑屏障是中枢神经系统疾病治疗亟待解决的一个关键问题。
　　 目前研究表明,通过脑毛细血管内皮细胞上的内源性受体介导的药物转运可能是脑内药物转运最有效的方法之一。研究者们将药物或基因转移载体与一些内源性受体,如转铁蛋白或胰岛素受体的单克隆抗体偶联后,显示出高效的脑内转运效率。但由于上述单克隆抗体和体内的转铁蛋白、胰岛素等内源性配体能发生竞争性抑制作用,从而妨碍了脑组织摄取营养物质或药物。最新研究表明,白喉毒素的无毒突变体--交叉反应物质197(cross-reacting material 197,CRM197)能够与分布在脑毛细血管内皮细胞上的白喉毒素受体(diphtheria toxin receptor,DTR)结合,转运大分子物质通过体外血脑屏障。由于CRM197作为荚膜多糖抗原载体蛋白或疫苗在国外已尝试应用于临床,而且在体内不存在与CRM197发生竞争性抑制作用的内源性配体,提示CRM197有可能成为新的更为有效的脑内药物转运载体。
　　 药物通过血脑屏障一般通过两条途径:即跨细胞途径和细胞旁途径。在跨细胞途径中,质膜微囊蛋白caveolae依赖性跨细胞途径在药物通过血脑屏障的过程中起着重要的作用。Caveolin-1是caveolae的标志性蛋白,在维持caveolae的形态、结构和功能中起重要作用。研究表明,FOXO转录因子能够直接与caveolin-1的启动子区结合,调节caveolin-1的表达。FOXO转录因子的活性受磷脂酰肌醇3激酶(phospatidyl-3-inositol-kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(v-akt routine thymomaviral oncogene homolog,Akt)磷酸化级联通路的调节,激活的Akt使FOXO发生磷酸化修饰导致转录失活。CRM197与DTR结合后可以抑制受体剪切,显著减少肝素结合表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor,HB-EGF)的形成,减弱由HB-EGF激活的PI3K/Akt等信号通路,进而可能参与对FOXO转录因子活性的调节,上调cavcolin-1的表达。
　　 药物通过血脑屏障的细胞旁途径主要是通过调节ZO-1(zonula occluden-1)、occludin、claudin-5等紧密连接相关蛋白和粘附连接蛋白等结构,开放紧密连接,增加血脑屏障通透性。目前对于CRM197主要通过何种途径介导大分子物质通过血脑屏障的研究尚未见报道。
　　 本研究主要明确CRM197作用前后对体外和在体水平血脑屏障的通透性、跨细胞途径和细胞旁途径的影响,以及在此过程中PI3K/Akt/FOXO1A信号途径是否参与对caveolin-1表达的调节。
　　 方法
　　 1、体外血脑屏障模型和CRM197-HRP(horseradish peroxidase)、BSA-HRP偶联物的制备。
　　 2、应用CRM197-HRP偶联物与人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3的结合实验和跨细胞转运实验检测CRM197-HRP的转运效果。
　　 3、应用Millicell-ERS电阻测量系统检测CRM197作用前后体外血脑屏障的跨内皮细胞电阻值(transendothelial electric resistance,TEER)的变化。
　　 4、应用伊文氏兰(Evans blue,EB)渗透性评估CRM197作用前后豚鼠血脑屏障通透性变化；透射电镜观察CRM197对脑微血管内皮细胞超微结构的影响。
　　 5、应用免疫组织化学法和免疫荧光法检测CRM197作用前后p-Akt、p-FOXO1A和紧密连接相关蛋白ZO-1在hCMEC/D3细胞中的分布和表达水平的变化；以及caveolin-1和DTR在豚鼠脑微血管中的分布和表达水平的变化。
　　 6、应用RT-PCR法检测CRM197作用前后hCMEC/D3细胞中caveolin-1 mRNA的表达水平；应用western blot法检测CRM197作用前后hCMEC/D3细胞和豚鼠脑微血管中caveolin-1、紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表达水平以及PI3K/Akt/FOXO1A信号通路活性的变化。
　　 结果
　　 1、成功建立了体外血脑屏障模型,获得了CRM197-HRP偶联物。
　　 2、CRM197-HRP与hCMEC/D3细胞的结合实验表明CRM197-HRP与hCMEC/D3细胞的结合水平呈时间依赖性增加,在60 min时达到最大值。
　　 3、CRM197能够以剂量依赖的方式增加豚鼠血脑屏障的通透性,其中300μg/kg CRM197为开放血脑屏障的最适剂量。CRM197能够增加脑微血管内皮细胞中吞饮小泡的数量,以300μg/kg剂量组增加最明显。CRM197作用后,脑微血管中DTR的表达水平显著减少。
　　 4、CRM197-HRP通过caveolae依赖性的跨细胞途径通过血脑屏障。Caveolin-1的mRNA和蛋白表达水平在CRM197作用后显著增加,在30 min时达到峰值。
　　 5、CRM197作用后,hCMEC/D3细胞中Akt和FOXO1A的蛋白磷酸化水平均显著下降,而总Akt的蛋白表达水平未发生变化；p-Akt在胞浆和胞核中的表达水平明显减弱；FOXO1A在细胞核中的分布增加。
　　 6、CRM197作用60 min后,体外血脑屏障的TEER值显著下降,hCMEC/D3细胞中紧密连接相关蛋白ZO-1在细胞膜上的表达减弱,而在胞浆中的表达明显增强。CRM197作用60 min后,豚鼠脑微血管中ZO-1和occludin的蛋白表达水平均显著减少。Claudin-5的蛋白表达水平在CRM197作用30 min时达到最低,而后增加。
　　 讨论
　　 本研究证明,CRM197不仅能介导大分子物质HRP(40 kDa)有效通过脑微血管内皮细胞,而且能以剂量依赖的方式增加豚鼠血脑屏障的通透性。CRM197作用后,脑微血管内皮细胞中吞饮小泡的数量增加。CRM197能够通过caveolae依赖的跨细胞途径增加血脑屏障通透性,这一过程伴有caveolin-1的mRNA和蛋白表达水平的增加,CRM197对PI3K/Akt信号途径的抑制以及对FOXO1A活性的调节能够参与对caveolin-1表达水平的调节。CRM197还能减少脑微血管中紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达,增加ZO-1在胞浆中的分布,增加血脑屏障通透性。综上所述,CRM197能够通过caveolae依赖性的跨细胞途径和细胞旁途径介导大分子物质通过血脑屏障。
　　 由于不同种属动物的细胞对CRM197的敏感性不同,人、猴、豚鼠等对CRM197敏感,而大鼠和小鼠不敏感。所以本研究主要以hCMEC/D3细胞和豚鼠为研究对象。我们首先采用hCMEC/D3细胞建立了体外血脑屏障模型,并以此为研究对象检测了CRM197-HRP与hCMEC/D3细胞的特异性结合和内化水平,证实了hCMEC/D3细胞对CRM197-HRP的摄取在5 min时开始增加,在60 min左右达到平衡。由于血浆中的白蛋白分子量较大(66 kDa),很难通过血脑屏障,经常作为对照来评价体外或在体血脑屏障的通透性变化。本研究中,CRM197-HRP与hCMEC/D3细胞的结合水平约为BSA-HRP的两倍,表明CRM197-HRP具有更好的内吞效果。在体外血脑屏障模型中,CRM197-HRP与hCMEC/D3细胞结合后从transwell小室的上室到下室的转运水平要显著高于其从下室到上室的转运水平,这种转运方向的优势有助于转运CRM197偶联物进入脑组织。在体研究表明,CRM197能够以剂量依赖的方式增加豚鼠血脑屏障的通透性,其中300μg/kg和500μg/kg剂量组间EB含量未见显著差异。考虑到临床应用的安全性,我们采用300 μg/kg剂量作为开放血脑屏障的最适剂量。CRM197作用后脑微血管中吞饮小泡的数量增加,提示跨细胞途径参与CRM197介导的转运过程。
　　 结论
　　 1、CRM197能够以剂量依赖的方式增加血脑屏障通透性,300 μg/kg CRM197为开放血脑屏障的最适剂量,这一过程伴有脑微血管内皮细胞中吞饮小泡数量的增加。
　　 2、CRM197-HRP能有效通过体外血脑屏障,这一过程主要与caveolae依赖性的跨细胞途径有关。
　　 3、CRM197能够显著抑制脑微血管内皮细胞中Akt和FOXO1A的磷酸化水平,增加FOXO1A在细胞核中的分布,上调caveolin-1的表达。
　　 4、CRM197能够调节紧密连接相关蛋白ZO-1在脑微血管内皮细胞中的分布,显著减少紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达,通过细胞旁途径增加血脑屏障通透性。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

论文一 白喉毒素无毒突变体CRM197介导大分子物质通过体外血脑屏障效果和机制的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 白喉毒素无毒突变体CRM97介导大分子物质通过豚鼠血脑屏障效果和机制的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

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参考文献

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