RNA干扰介导ABCE1基因沉默对人肺腺癌的影响及其下游差异基因的筛选

摘要

前言
　　 肺癌是呼吸系统常见肿瘤,腺癌是肺癌最主要的组织学类型之一,发病机制目前仍未明确。尽管早期诊断、早期治疗取得了很大进展,但手术后仍有许多患者死于复发和转移。肺癌组织中某些生物学标志物的表达可能影响患者的预后,而根据这些特殊标志物的表达情况采取的治疗措施可能改善患者的预后,因此,寻找新的肿瘤分子标志物用于肺癌的早期诊断、监测病情进展、指导治疗是目前一个研究热点。
　　 我们课题组前期在田大力教授的指导下,应用mRNA荧光差异显示法筛选肺癌发生转移相关基因的研究发现了与ABCE1基因高度同源的片段,后通过RACE法明确为ABCE1基因。以往对ABCE1的研究,主要集中在干扰素介导的2-5A/Rnase L细胞抗病毒通路中。ABCE1作为该通路核心酶Rnase L(核糖核酸酶L)的抑制剂,参与通路的调控。而后的研究发现ABCE1属于高度保守的序列,在真核及原核生物细胞内普遍表达,然而,在真核生物界外未发现干扰素的存在,这提示ABCE1还存在其它重要功能。最近的研究表明,ABCE1蛋白通过与翻译起始因子eIF2α和eIF5的结合在mRNA翻译的起始过程中发挥着必要的作用。体外实验中,在人类肿瘤细胞株中抑制ABCE1的表达,可阻碍肿瘤细胞的生长。
　　 如上所述,在肺腺癌的发生、发展过程中是否有ABCE1的参与?在这一演变过程中ABCE1发挥什么作用?目前还不清楚。因此,以此为切入点,本研究我们将探讨ABCE1基因在肺腺癌演变过程中的作用及其机制。
　　 论文一:ABCE1在肺腺癌组织细胞中的表达及临床意义
　　 我们收集18例肺腺癌组织、15例转移淋巴结组织标本和17例癌旁肺组织标本,用RT-PCR及Western-Blot方法研究ABCE1在不同组织类型、不同病理分期中mRNA和蛋白的表达,结合临床资料,探讨ABCE1与肺腺癌发生发展的关系和临床意义。同时我们用RT-PCR方法检测ABCE1基因在人肺腺癌细胞株A549中是否存在表达。结果显示三种组织中均存在ABCE1的表达;肿腺癌组织ABCE1蛋白及mRNA的表达量高于正常肺组织(P＜0.05,P＜0.05);转移淋巴结组织中ABCE1蛋白及mRNA的表达量高于肺腺癌组织(P＜0.05,P＜0.05);18例肺腺癌中ABCE1蛋白及mRNA的表达量在Ⅲ期高于Ⅰ、Ⅱ期(P＜0.05,P＜0.05);N1组高于N0组(P＜0.05,P＜0.05)。同时我们的实验还证实A549细胞中存在ABCE1的表达。研究结果提示ABCE1基因可能参与了肺腺癌的形成和演变,其表达水平在一定程度上可以反映肺腺癌的转归,有望成为新的肿瘤分子标志物用于肿瘤的早期诊断、病情检测和预后评估。
　　 论文二:RNA干扰介导ABCE1基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响
　　 RNA干扰技术是近几年迅速发展起来的基因阻断技术,将与目的基因同源的小片段双链RNA分子导人细胞内,进而特异性的降解目的基因的mRNA,是基因诊断、基因治疗的有利工具。我们根据文献选择ABCE1基因cDNA序列中71bp的核苷酸序列为RNA干扰的靶序列,选择了表达绿色荧光蛋白、对肺腺癌A549细胞具有高感染效率的慢病毒载体pSC-GFP,构建含ABCE1特异性shRNA序列的质粒,经包装细胞包装后制备可表达ABCE1基因特异性siRNA的载体病毒颗粒,直接感染人肺腺癌A549细胞以阻断细胞ABCE1基因的表达。筛选出稳定表达pSC-ABCE1的细胞株。用Western Blot和RT-PCR方法检测ABCE1蛋白及mRNA的表达水平;MTT实验观察pSC-ABCE1对肿瘤细胞生长活性的影响。通过下调ABCE1在肿瘤细胞内的表达水平,来阐明ABCE1在肿瘤细胞中的作用。结果显示pSC-ABCE1-shRNA抑制了ABCE1基因mRNA和蛋白的表达,A549细胞的增殖受到抑制。实验结果结合文献提示ABCE1基因通过抑制翻译起始复合物的形成,而在细胞增殖中发挥生物学作用,ABCE1基因可能是肺腺癌基因治疗的有效靶点,RNAi可以成为基因治疗的有力工具.
　　 论文三:人肺腺癌A549细胞株ABCE1基因RNA干扰后基因表达谱的差异分析
　　 为进一步明确ABCE1基因的作用机制,我们采用基因芯片技术研究了SiRNA介导ABCE1基因沉默后人肺腺癌A549细胞基因表达谱变化。我们采用的Illumina公司Human WG-6 V3 Beadchip KIT基因表达芯片,将实验样品荧光标记,芯片杂交后,Illumina BeadArray Reader软件进行图象分析。结果:差异明显表达的基因共476个,RNAi组差异表达上调基因149个,下调基因327个。在GeneBank进行检索后初步分类,有405个功能分类基因,大致分为免疫炎症反应基因、信号传导基因、代谢相关基因、细胞增殖、发育、分化相关基因、凝血相关基因、蛋白质转录、翻译、修饰相关基因、细胞黏附和凋亡相关基因12个功能分类。45个未分类基因,46个未知基因表达序列。提示ABCE1可能通过影响其下游基因的表达变化参与肿瘤的形成,ABCE1基因可能是肿瘤细胞的潜在标志物。