PLGA-HA复合支架与异体骨体外细胞相容性的对比实验研究

摘要

实验目的
　　 研究新型多孔聚乳酸乙醇酸/羟基磷灰石(PLGA/HA)支架材料的体外细胞相容性。采用贴壁法对兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行体外矿化诱导培养,扩增后与实验组(含10％HA的PLGA/HA),对照组(异体骨)分别进行体外复合培养；并通过定性及定量法检测BMSCs在材料表面的粘附能力、增殖活力,验证细胞材料复合体的成骨活性。比较分析两组之间的差异。结果显示兔BMSCs在PLGA/HA及异体骨材料的表面均能生长,经体外诱导后可形成钙结节,PLGA/HA组细胞的粘附及增殖能力不弱于异体骨组,两组之间无统计学差异。
　　 实验材料与方法
　　 抽取3只新西兰大耳白兔骨髓间充干细胞,经体外分离、培养、扩增、传代,并纯化骨髓间充质干细胞。取经诱导培养的第3代兔BM-SCs,消化后使细胞浓度为1×106/ml。用移液器吸取细胞悬液,分别接种在支架材料与异体骨上,直至饱和。将培养板置于50％CO2培养箱内孵育4h后,按上述方法再接种一次每块材料上接种细胞约1×105,然后加入诱导培养液浸没材料,置于5％CO2培养箱内。隔天换液。在倒置相差显微镜下,逐日观察原代和传代细胞形态及粘附增殖情况。于接种后4 h,分别取每种材料各2个样本细胞计数板计算贴壁细胞数[细胞粘附率(％)=贴壁细胞数/接种细胞数×100％]。分别于接种后第3、7天,取出每种材料各2样本,细胞计数板进行计数,各组取平均值,比较各组细胞增殖情况。分别于联合培养后第7天与14天,选择每种材料各2个孔,进行碱性磷酸酶(alka linephosphatase,ALP)活性定量检测。配置10μg/ml的盐酸四环素,加入原诱导培养液中,抽滤除菌。于联合培养14 d后,弃原培养液,加入上述液体继续培养,24h后在荧光显微镜下观察钙结节形成情况。
　　 统计学处理,对细胞粘附率及ALP活性的定量进行处理,并进行数据分析。
　　 实验结果
　　 1 细胞体外培养的观察BMSCc原代培养约5 d后贴壁生长,逐渐形成克隆,红细胞通过换液去除,10～12 d汇合,前两代生长迅速,细胞呈成纤维细胞型,多为梭形和不规则三角形,细胞排列呈漩涡状、放射状。
　　 2 细胞粘附率的测定接种4 h后,每组材料的细胞粘附率:PLGA/HA组为33％;异体骨组为31％
　　 3 细胞增殖的情况 接种后第3、7天,细胞计数见图1。PLGA/HA与异体骨组比较差异无统计学意义；(p>0.1)
　　 4 ALP活性的定量检测 见表1接种培养第7,14天,PLGA/HA组与异体骨组比较差异有无显著意义(p>0.1)
　　 5 钙结节的检测 复合培养两周后,两组均可见明显的钙结节形成,并随时间的延长而增大,四环素染色后出绿色荧光(图2)
　　 结论
　　 结果显示,各材料分别与BMSCs复合培养后,其细胞蛋白及ALP活性均存在,说明细胞在材料上均可以增殖、分泌并表达其功能。本实验的结果说明,PLGA/HA支架材料其细胞粘附增殖能力不低于异体骨。在本研究中,采用PLGA/HA多孔支架材料进行体外细胞复合实验,并与异体骨组作为对比。为后续的PLGA/HA多孔支架修复骨不连的动物体内实验研究打下了良好的基础。

目录

文摘

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英文缩略

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

参考文献

致谢

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