创伤后应激障碍大鼠海马神经元凋亡相关基因及线粒体通路机制的研究

摘要

前言
　　 创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder,PTSD)是由于异常威胁性或灾难性心理创伤导致出现长期持续性精神障碍,其临床表现以再度体验创伤为特征,并伴有情绪的易激惹和回避行为。简而言之,PTSD是一种创伤后心理失衡状态[1,2]。近年来,随着战争、社会暴力事件、重大交通事故和自然灾害等创伤意外的不断增多,PTSD已经成为一种普遍的精神障碍而被关注[3]。目前,PTSD及其神经生物学致病机制的探讨已成为涉及创伤学、神经精神病学、心理学等跨学科研究的重点。
　　 下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴系统在应激反应调控中有重要作用。研究发现,PTSD不同于一般的应激反应及其它精神疾病,PTSD患者血液中的皮质酮基础水平往往较低,存在HPA轴的紊乱[4]。糖皮质激素(GC)是肾上腺皮质分泌的重要应激激素。GC受体有糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor,GR)和盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)。海马是学习记忆的重要脑区,也是脑部GR含量最高的区域,因此在应激过程中海马是糖皮质激素攻击的主要靶区[5]。近年来,对遭受战争和暴力之后的PTSD患者进行磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)检查,发现有海马萎缩的现象[6]。PTSD患者海马的形态结构在应激反应中发生了明显的变化,主要表现为体积变小[7],但其发生机制目前尚不明确。
　　 细胞凋亡是由基因控制的细胞主动性死亡过程,是机体生长发育、细胞分化、生理及病理性死亡的重要机制。细胞凋亡的调控,主要有三条诱导途径:外源性途径,即死亡受体途径；内源性途径,即线粒体途径；此外还有内质网途径[8,9]。不同的死亡信号通过不同的途径诱导细胞凋亡。长期以来,线粒体一直被公认为细胞内的能量加工厂,其主要作用是为细胞的各种生命活动提供所需的能量。但越来越多的研究表明,在细胞凋亡过程中,许多重要事件的发生都与线粒体密切相关,如线粒体膜电位的丧失、细胞色素C(Cytochrome C,CytC)的释放、Bcl-2家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等等[10]。线粒体是细胞内死亡信号的重要感受器与放大器。在细胞凋亡早期,核染色体DNA还未改变之前,已出现线粒体结构和功能的变化,说明线粒体在细胞凋亡调控过程中起重要作用[11]。凋亡信号经线粒体放大,线粒体再释放CytC、Smac/DIABLO和丝氨酸蛋白Omi/HtrA2,激活Caspase级联反应,最终引起凋亡,这是Caspase依赖的信号传导通路。线粒体也可释放凋亡诱导因子(apoptosis induce factor,AIF)、核酸内切酶G直接引起凋亡,这是Caspase非依赖的信号传导途径[12]。
　　 线粒体在细胞凋亡机制中的作用越来越受到人们的关注。于是,有人提出GC受体可以与线粒体作用而诱导细胞凋亡的假说[13]:第一,非基因组的作用。应激活化的大量GR可以直接与线粒体膜结合而改变线粒体膜电位。第二,基因组的作用。GC可以与其他的一些分子如热休克蛋白等相互作用,从而易位入细胞核,与DNA结合并影响转录活动。Bax作为GR活化的下游调制器之一,可以被上调并易位入线粒体与凋亡调制器MAP-1结合。这两种方式均可以导致线粒体膜电位改变。线粒体膜电位下降,即可引起线粒体膜间隙的CytC释放至胞质。释放入胞质的CytC在ATP或dATP的辅助下可特异地与凋亡蛋白酶激活因子(Apoptoticprotease activating factors,Apaf-1)结合成复合体,启动Caspase-9形成全酶,导致Caspase-9活化。后者继续激活其下游分子,包括Caspase-3等,从而诱导细胞凋亡[14]。
　　 在我国,由于地震、洪水等自然灾害时有发生,灾后一些人会出现长期焦虑与激动情绪。同时随着社会的发展、生活的节奏加快,来自社会、家庭、工作的压力不断增大,这些均成为PTSD诱发因素。因而如何治疗这些因灾难、压力而引起的精神疾病是一个刻不容缓的课题。以往由于缺乏理想的动物模型,使PTSD的基础研究受到了很大限制。SPS模型作为PTSD动物模型的确认,为深入研究应激障碍的发病机理提供了行之有效的方法。目前,关于PTSD细胞凋亡的研究国内外尚未见报道。因此,本课题引用国际上最新的SPS做为PTSD动物模型来进行PTSD的基础研究,首次揭示PTSD海马细胞凋亡、凋亡相关基因及线粒体通路的调控机制,从而为这一疾病的预防、诊断和治疗寻找一条有效的途径。
　　 实验方法
　　 采用国际认定的无连续单一应激(Single-Prolonged Stress,SPS)方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型。应用原位末端标记法(TUNEL染色法)检测PTSD大鼠海马细胞凋亡的规律；应用透射电子显微镜术观察PTSD大鼠海马凋亡细胞形态学变化；应用体视学方法测定PTSD大鼠海马体积的变化；应用免疫组织化学技术、免疫荧光技术及免疫印迹技术检测PTSD大鼠海马神经元凋亡相关因子Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-9和Caspase-3蛋白含量的变化；应用RT-PCR技术检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax mRNA含量的变化；应用免疫双标、激光共聚焦扫描显微镜技术观察PTSD大鼠海马Bcl-2和Bax以及Caspase-9和Caspase-3的表达与共存；应用酶电镜细胞化学技术观察PTSD大鼠海马线粒体细胞色素C的表达与释放。
　　 结论
　　 1、PTSD大鼠出现了海马萎缩现象,神经元凋亡可能是导致PTSD大鼠海马发生萎缩的因为之一。
　　 2、凋亡相关基因Bcl-2和Bax含量增加以及两者比值的失衡可能是导致PTSD大鼠海马神经元发生凋亡的重要机制。
　　 3、在PTSD大鼠海马神经元中,线粒体肿胀、外膜破裂,大量CytC释放入胞质。
　　 4、CytC从线粒体释放入胞质是引发PTSD大鼠海马神经元凋亡的关键步骤。
　　 5、Caspase-9和Caspase-3在PTSD大鼠海马神经元凋亡的调控中均发挥了重要作用,线粒体通路的激活参与了PTSD大鼠海马神经元凋亡的调控。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

论文一

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述

参考文献

在学期间科研成绩

致谢

个人简历