TNFα在暴发性肝衰竭致肝肾综合征大鼠肾小球滤过率下降机制中的研究

摘要

目的:
　　肝肾综合征(HRS)的主要发病机制是肾小球滤过率(GFR)明显下降。已知肾小球系膜细胞(GMC)收缩引起的肾小球滤过面积减少和肾小球入球动脉平滑肌细胞(VSMC)收缩引起的肾小球血液灌注降低，均可使GFR下降。而GMC、VSMC收缩又与胞浆游离Ca2+浓度([Ca2+]i)升高密切相关。Ⅰ型1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP3RI）是细胞内重要的Ca2+释放通道，因此是我们的研究指标。肿瘤坏死因子α(TNFα)是单核巨噬细胞产生的具有多种生物学活性的细胞因子，是引起重症肝病发生发展的主要因子。TNFα与TNFR结合后通过PKCα途径使GMC、VSMC内IP3RI过度表达。而ET-1通过磷脂酰肌醇4，5-二磷酸磷酸化，使GMC及VSMC中IP3产生增多，IP3与IP3RI结合后引起胞内钙释放，胞浆[Ca2+]i升高。HRS时血中TNFα水平异常升高，TNFα是否参与了GMC、VSMC收缩，从而引起GFR下降尚不清楚。D-氨基半乳糖(D-GaIN)联合脂多糖(LPS)诱导暴发性肝衰竭(FHF)大鼠构建HRS模型，采用微渗透泵植入方法，用FITC-Inulin作为标记物测定GFR，检测肾组织中IR3RI蛋白及IP3RI mRNA表达。然后分别用抗TNFα单克隆抗体、2-氨基乙基二苯硼酸盐(2-APB)阻断TNFα、IR3RI，再测定此时血中TNFα水平及GFR，观察TNFα在其中的作用，为研究HRS时GFR下降的发病机制提供理论依据。
　　材料与方法:
　　1、材料
　　选择SPF级别雄性SD大鼠，体重220±20g。实验前分笼饲养，室温23±3℃，每隔12h开灯照明，普通饲料，自由饮水，饲养一周后用于实验。
　　2、方法
　　(1)构建HRS模型:尾静脉注射D-GaIN(400mg/kg)、LPS（32μg/kg）的生理盐水溶液。分别在给药后1h、3h、6h、9h、12h、16h、24h采集血液，然后离心(3500r，4℃，5min)，取500μl上清液用于肝肾功能生物化学指标检测，其余血清-80℃保存用于检测细胞因子TNFα、内皮素-1(ET-1)。剪取部分肝肾组织置于组织固定液中，用于病理学检查，其余组织-80℃保存。
　　(2)分组:分组1:0h，G/L1h、3h、6h、9h、12h、16h、24h，G1h、3h、6h、9h、12h、16h、24h, L1h、3h、6h、9h、12h、16h、24h;分组2:NS组、G/L12h组、G12h组、L12h组;分组3:NS组、G/L12h（G/L组）、G12h（G组）、L12h(L组)、anti-TNFα-G/L12h(T组)、2APB-G/L12h(A组)。
　　(3)测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、钾离子(K+)、钠离子(Na+)、氯离子(Cl-);应用酶联免疫吸附实验方法测定血清TNFα、ET-1水平。
　　(4)肝组织常规HE染色，光镜下观察肝细胞坏死情况;电镜下观察肾组织结构是否发生改变。
　　(5)根据肝肾功能损害及肝细胞坏死情况，确定阻断时间点为建模后12h。
　　(6)将注有FITC-Inulin溶液的微渗透泵植入大鼠腹腔，第7天构建NS组、G/L12h组、G12h组、L12h组模型（每组各设置5只大鼠），12h后采集血液，应用荧光分光光度计测定血清FITC荧光量，根据公式GFR=R/[Iss]计算GFR，GFR1(ml·min-1)，GFR2(ml·min-1·kgBW-1)，GFR3（ml·min-1·gKW-1）。结合之前检测结果，确定HRS建模成功。
　　(7)应用Western-blot、Real-time PCR方法检测肾组织中IP3RI蛋白及IP3RImRNA表达情况。
　　(8)将注有FITC-Inulin溶液的微渗透泵植入大鼠腹腔，按照分组3在植泵后第7天建模，其中T组、A组分别在建模前30min尾静脉注射抗TNFα单克隆抗体、2-APB，12h后采集血液、肝肾组织标本。
　　(9)应用荧光分光光度计测定血清FITC荧光量，根据公式GFR=R/[Iss]计算GFR, GFR1(ml· min-1), GFR2(ml·min-1·kgBW-1), GFR3(ml·min-1· gKW-1),观察抗TNFα抗体、2-APB对GFR的影响。
　　(10)应用Western-blot、Real-time PCR方法检测分组3各实验组大鼠肾组织IP3RI蛋白及IP3RI mRNA表达情况，研究抗TNFα抗体、2-APB对IP3RI表达的影响。
　　(11)测定分组3各实验组大鼠血清TNFα、ET-1水平，观察抗TNFα抗体、2-APB的阻断特异性。再测定ALT、BUN、Cr、K+、Na+、Cl-水平，肝组织进行病理学检查，观察抗TNFα抗体、2-APB对肝肾功能及肝细胞坏死的影响。
　　结果:
　　1、血清肝肾功能生物化学指标及细胞因子检测结果
　　G/L组ALT、BUN、Cr、TNFα、ET-1均在给药后12h明显升高达到峰值，与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)，并且在12h时间点G/L组上述五项指标分别与G组、L组比较，均有显著性差异(P＜0.05)，从客观上除外D-GalN、LPS药物本身对五项指标的影响。K+浓度分别在给药后3h、12h各出现一次峰值，Cl-浓度在给药后12h明显降低，与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05);Na+浓度无明显变化。
　　2、肝肾组织学病理检查结果
　　肉眼观察D-GalN/LPS联合给药后12h肝脏呈酱紫色，充血肿胀，弥漫出血点，切面有暗红色淤血或黄色乳糜状坏死物质溢出。光镜下肝细胞大块坏死，没有肝细胞再生，纤维间隔塌陷，充填大量红细胞。电镜下观察肾小球、近曲小管、远曲小管结构均正常。
　　3、NS组、G/L12h组、G12h组、L12h组GFR结果
　　G/L12h组GFR与NS组比较明显降低，降至NS组的33.4％，有显著性差异(P＜0.05)。G/L12h组GFR再分别与G12h组、L12h组相比，差异均有显著性(P＜0.05)。
　　4、Western-blot半定量分析IP3RI蛋白表达
　　对照组IP3RI蛋白表达水平较低;G/L组从3h开始IP3RI蛋白表达增加，以12h最为明显，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。在12h时间点G/L组IP3RI蛋白表达水平分别与G组、L组比较，均有显著性差异(P＜0.05)。
　　5、Real-time PCR分析IP3RI mRNA表达
　　D-GalN/LPS联合给药后IP3RI mRNA表达增加，以9h最明显，与NS对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。在9h时间点G/L组IP3RI mRNA表达水平分别与G组、L组比较，均有显著性差异(P＜0.05)。
　　6、T组、A组GFR计算结果
　　T组、A组的GFR与G/L组比较明显增加，有显著性差异(P＜0.05);与NS对照组比较，T组、A组校正后的GFR(GFR2，GFR3)比校正前(GFR1)更接近正常水平。再将T组与A组进行组间比较，无显著性差异(P＞0.05)。
　　7、Western-blot半定量分析抗TNFα抗体、2-APB对IP3RI蛋白表达的影响
　　D-GalN/LPS联合给药后12h及A组IP3RI蛋白呈高水平表达，两者之间无显著性差异(P＞0.05);而T组IP3RI蛋白表达明显减少，与G/L组比较有显著性差异(P＜0.05);A组、T组进行组间比较有显著性差异(P＜0.05)。
　　8、Real-time PCR分析抗TNFα抗体、2-APB对IP3RI mRNA表达的影响
　　D-GalN/LPS联合给药后9h IP3RI mRNA表达明显增加，T组IP3RI mRNA表达明显下降，两者比较有显著性差异(P＜0.05);而A组IP3RI mRNA表达水平与G/L组相近，差异无显著性(P＞0.05)。
　　9、抗TNFα抗体、2-APB对肝肾功能生物化学指标及细胞因子水平的影响
　　T组、A组的ALT、BUN、Cr水平与G/L组比较均明显降低，有显著性差异(P＜0.05);T组ALT降低84％，A组ALT降低44％，两者比较，差异有显著性(P＜0.05)，而BUN、Cr降低程度两者相比无显著性差异(P＞0.05); G/L组出现明显高钾、低钠、低氯血症，而T组、A组K+、Na+、Cl-浓度均恢复正常，再将T组、A组进行组间比较，无显著性差异(P＞0.05)。
　　10、抗TNFα抗体、2-APB对肝细胞坏死的影响
　　T组肝细胞呈点状或小灶状坏死，A组肝细胞呈明显灶状或小片状坏死。
　　结论:
　　1、D-GalN/LPS联合打击SD大鼠，在动物水平模拟了人HRS的部分病理生理过程，成功构建HRS动物模型。
　　2、D-GalN/LPS联合打击后12h肝肾功能损害及肝细胞坏死最严重，GFR下降最明显，因此是HRS成模时间点，也是我们选择的阻断时间点。
　　3、HRS时IP3RI蛋白表达明显增加，其上调时相与血中TNFα、ET-1升高时相一致。
　　4、IP3RI蛋白表达在转录水平受IP3RI mRNA的调控。
　　5、抗TNFα抗体预先阻断后，大鼠肾脏IP3RI蛋白及IP3RI mRNA表达明显减少，GFR却显著增加，揭示了TNFα是通过上调IP3RI蛋白及IP3RI mRNA表达，导致GFR降低。
　　6、2-APB预先阻断后，虽然大鼠肾脏IP3RI蛋白及IP3RI mRNA表达无明显降低，但是GFR却显著增加，表明2-APB对GFR降低的改善，不是由于下调IP3RI蛋白及IP3RI mRNA的表达，而是由于2-APB有效地阻断了IP3RI的活性。同时也揭示了IP3RI是肾脏内影响GFR的重要信号转导通路之一。
　　7、抗TNFα抗体、2-APB对于改善HRS肾脏功能效果相近。
　　8、抗TNFα抗体在减轻肝细胞坏死，改善肝功能方面明显强于2-APB。
　　9、体重、肾脏重量校正后的GFR能更准确地反映肾小球滤过功能，并且两种校正方法的比较结果相似。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导SD大鼠构建肝肾综合征模型

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 肝肾综合征大鼠肾脏Ⅰ型1，4，5-三磷酸肌醇受体的表达

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三 抗TNFα抗体、2-APB对肝肾综合征大鼠肾小球滤过率的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 肝肾综合征肾小球滤过率降低机制

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