Rho激酶抑制剂对OIR大鼠视网膜形态及ROCK-2和ICAM-1的蛋白和mRNA表达的影响

摘要

目的：
　　 探讨Rho-Rho激酶信号通路在缺血缺氧性视网膜病变中的作用，法舒地尔作为Rho激酶抑制剂在心脑血管缺血性疾病的治疗中已经应用于临床。我们建立法舒地尔给药后大鼠的氧诱导视网膜病变oxygen-induced retinopathy(OIR)模型，评价法舒地尔给药对视网膜新生血管形成的干扰作用。
　　 方法：
　　 第一部分:将18只鼠龄7d的清洁级SD大鼠随机分为正常对照组和模型对照组，模型给药组各6只。正常对照组于正常空气环境中饲养，不予任何处理;氧诱导模型组（包括对照组，给药组）于出生后第7天的幼鼠.与哺乳母鼠一起连续5天放入75％的氧箱后回到正常环境中饲养。三组幼鼠均在出生后17天处死，取双侧眼球，一眼行ADP酶组化视网膜铺片染色，另一只眼留作石蜡切片，行HE染色及后续的免疫组织化学染色，记数视网膜新生血管内皮细胞数。
　　 第二部分:将72只鼠龄7d的清洁级SD大鼠随机分为正常对照组和模型对照组，模型给药组各24只。正常对照组于正常空气环境中饲养，不予任何处理;氧诱导模型组（包括对照组，给药组）于出生后第7天的幼鼠.与哺乳母鼠一起连续5天放入75％的氧箱后回到正常环境中饲养。三组幼鼠均在出生后17天处死，三组各6份石蜡切片，行ROCK-2免疫组织化学染色;每份2只眼视网膜组织，进行实时荧光定量PCR检测ROCK-2的mRNA表达量;每份4只眼视网膜组织，进行western blot检测 ROCK-2的蛋白表达量。
　　 第三部分:将72只鼠龄7d的清洁级SD大鼠随机分为正常对照组和模型对照组，模型给药组各24只。正常对照组于正常空气环境中饲养，不予任何处理;氧诱导模型组（包括对照组，给药组）于出生后第7天的幼鼠.与哺乳母鼠一起连续5天放入75％的氧箱后回到正常环境中饲养。三组幼鼠均在出生后17天处死，三组各6份石蜡切片，进行ICAM-1免疫组织化学染色;每份2只眼视网膜组织，进行实时荧光定量PCR检测ICAM-1的mRNA表达量;每份4只眼视网膜组织，进行western blot检测ICAM-1的蛋白表达量。
　　 结果：
　　 第一部分:实验组(N=6)ADP酶染色视网膜铺片可见从视盘发出的大血管略迂曲扩张，视盘周围及中周部有大片无灌注区形成，可见新生血管团增殖，无灌注区周围可见大量新生血管出芽;给药组(N=6)视网膜铺片可见从视盘发出的大血管明显迂曲扩张，视盘周围及中周部有局部无灌注区形成，无灌注区周围大量新生血管渐成网状，深层毛细血管网隐约可见。后极部4PD无灌注区面积少于高氧对照组。HE染色，及视网膜血管内皮细胞记数:正常对照组，高氧对照组，高氧给药组（X400倍）每组各6只鼠共120张切片结果显示:高氧对照组视网膜表面失去了正常光滑的界面，在视网膜前和神经纤维层可见炎性细胞，毛细血管突破内界膜长入玻璃体。模型给药组视网膜表面界面较光滑，在视网膜前和神经纤维层可见大量新生血管芽及毛细血管内皮细胞核。空白对照组、高氧对照组，高氧给药组的HE染色视网膜血管计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数目分别为3.5±0.9，24.6±1.1和24.0±0.8，高氧对照组，高氧给药组分别与空白对照组比较有统计学差异(t=15.251，8.198，P=0.000，0.000,高氧对照组与给药组比较无统计学差异(t=1.219，P=0.159)。
　　 第二部分:免疫组化三组视网膜内核层和内丛状层和神经纤维层内皮细胞均有ROCKⅡ的表达，且实验对照组有较强的表达。与空白对照组相比，ROCKⅡ在高氧对照组和给药组t=3.942，4.567，P=0.001，0.011，有统计学差异。在实验组和给药组比较t=4.942，P=0.013，有统计学差异。RT-PCR正常组17天ROCK-2的明显升高，高氧实验组与给药组ROCK-2的mRNA的表达无统计学差异。Western Blot实验组与给药组t=3.671，P=0.014;实验组与空白组比较t=25.791，P=0.000;给药组与空白组比较=6.882，P=0.001.三组均有统计学差异。
　　 第三部分:RT高氧对照组的ⅡCAM-1 mRNA的表达在17天之前明显高于正常水平t=4.126，P=0.011，差异有统计学意义。法舒地尔17天给药组与实验组t=-3.563，P=0.012，差异有统计学意义。WB实验组与给药组t=3.768，P=0.013，给药组与空白组比较t=-7.357，P=0.001，比较均有统计学差异。实验组与空白组比较t=1.536，P=0.185，无统计学差异。免疫组织化学结果，给药组CAM-1蛋白的表达在17d表达明显减少，实验组ICAM-1蛋白表达在视网膜内界膜及其表面增殖膜聚集性表达增强，视网膜表面失去了正常光滑的界面，在视网膜前和神经纤维层可见炎性细胞浸润，毛细血管突破内界膜长入玻璃体。而给药组视网膜表面内界膜面较光滑，后极部视网膜厚度与正常对照组相仿。
　　 结论：
　　 第一部分:在本模型中，可能由于在相对低氧环境无灌注区最初形成于后极部，新生血管的产生使血眼屏障受到破坏，法舒地尔全身给药的效果明显，在高氧给药组中，法舒地尔全身给药的视网膜铺片显示视网膜中央动静脉血管一致性迂曲扩张，可能与视网膜中央动脉扩张，导致血流增加，致使视网膜中央静脉回流压力加重有关。本实验中高氧给药组视网膜表面神经纤维层新生血管网的形成，减少了后极部无灌注区的面积，加快了侧枝循环的重建，促进毛细血管出芽，视网膜血管计数高氧对照组与给药组比较无明显统计学差异。
　　 第二部分:本研究中免疫组化三组视网膜内核层和内丛状层和神经纤维层内皮细胞均有ROCKⅡ的表达，且实验对照组有较强的表达，证明ROCKⅡ视网膜缺血缺氧性损伤有关。在正常组的17天ROCK-2的mRNA表达明显增高，还需要进一步研究，可能与正常的视网膜生理功能的改建有关。给药组的ROCK-2蛋白表达免疫组化图片与实验组比较分析无明显统计学差异，但Western的ROCK-2蛋白定量与实验组比较有明显统计学差异，Real-time的mRNA的比较无统计学差异。
　　 第三部分:法舒地尔不但抑制ICAM-1的转录和翻译，而且影响到视网膜中ICAM-1的分布与聚集，进而可能抑制了白细胞与血管内皮细胞之间的粘附;给药组视网膜铺片显示视网膜血管迂曲扩张明显加重，但视网膜表面神经纤维层内的新生血管网的形成明显加快，血液动力学的改善也可能使白细胞与血管壁的粘附率降低。给药组视网膜铺片较实验组减少了后极部无灌注区的面积，视网膜的炎症与水肿得到有效地控制，

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 法舒地尔给药后氧诱导的大鼠视网膜新生血管模型的建立

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 Rho激酶抑制剂法舒地尔腹腔注药后OIR模型大鼠视网膜中ROCK-2 mRNA和蛋白的表达

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 Rho激酶抑制剂法舒地尔腹腔注药后大鼠OIR模型视网膜中ICAM-1 mRNA和蛋白的表达

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究的创新性的自我评价

参考文献

综述

致谢

个人简介