丁基苯酞对沙土鼠全脑缺血再灌注损伤后p-ERK、Caspase-3表达的影响

摘要

缺血性脑卒中具有发病率高、死亡率高、致残率高等特点，因此缺血性脑卒中的防治成为社会和医学界关注的重要课题。缺血再灌注损伤的程度是决定缺血性脑卒中预后的重要因素。近年来关于脑缺血再灌注损伤的发病机制、病理变化及其防治的研究越来越多。丁基苯酞（dl-3n-butylphthalide，NBP）是由中国医学科学院药物研究所研制的，2002年已经被国家食品药品监督管理局批准为治疗缺血性脑卒中的一类新药。已有一些研究表明NBP能够从多个环节改善脑缺血的损伤。
　　 许多研究证明，细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated proteinkinase，ERK）对脑缺血再灌注损伤后细胞的增殖、分化、凋亡起到重要调控作用。而Caspase-3则直接参与脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的发生，是凋亡通路的重要枢纽。
　　 本次实验，我们采用沙土鼠全脑缺血再灌注模型动态观察NBP对脑缺血再灌注损伤后p-ERK、Caspase-3表达的影响，
　　 实验材料和方法：
　　 1、动物分组
　　 54只健康雄性沙土鼠（体重60-70g）随机分为3组：假手术组（CON）、缺血再灌注组（I/R）、NBP治疗组（I/R+NBP），每组又分为3个亚组（1d、3d、7d）。假手术组仅游离双侧颈总动脉但不阻断，腹腔注射植物油。缺血再灌注组行双侧颈总动脉钳夹术，缺血后10分钟松开夹子立即腹腔注射植物油。NBP治疗组造模过程同缺血再灌注组，于缺血后10分钟松开夹子立即腹腔注射NBP 40mg/kg。以上各组分别于再灌注1d、3d、7d用Western Blot法检测海马CA1区p-ERK和caspase-3的表达，用Nissl染色法观察海马CA1区神经锥体细胞的变化。
　　 2、沙土鼠全脑缺血再灌注模型制备
　　 采用双侧颈总动脉钳夹术制作沙土鼠全脑缺血再灌注模型
　　 3、Nissl染色
　　 每只沙土鼠从右侧大脑半球分离出海马组织做石蜡切片，石蜡切片再脱蜡后脱经ddH2O冲洗，然后放在Nissl染液中染色，结束后两次顺序脱水，最后中性树胶封片。镜下观察海马CA1区神经锥体细胞的变化。
　　 4、Western blot法测沙土鼠海马CA1区p-ERK、Caspase-3
　　 每只沙土鼠从左侧大脑半球分离出海马组织，经称重、制备蛋白样品、行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、再转印到PVDF膜上。封闭后分别同多克隆抗磷酸化ERK抗体和兔抗Caspase-3多克隆抗体4℃水平摇床过夜。然后同相应二抗室温下水平摇床1h，TBST洗膜10min×3次，发光显色，用ImageJ对目的条带进行分析。
　　 结果：
　　 1、光镜下，与缺血再灌注组相对照，NBP治疗组细胞排列较整齐，细胞大而圆，尼氏体深染，但仍可见少量胞浆浓染。从锥体细胞数的变化上，再灌注组神经元大量减少，不着色，NBP治疗组神经元数量较多（p<0.01）。再灌注3d椎体细胞减少最多，NBP组与再灌注组趋势一致。
　　 2、1d时NBP组较缺血再灌注组p-ERK升高明显，具有统计学意义（p<0.05）.3d时两组的表达均有所下降，但NBP组仍明显高于再灌注组（p<0.01）.7d时再灌注组的表达再次升高，而NBP组降至同假手术组。两组差别有统计学意义（p<0.01）。
　　 3、1d时NBP治疗组可以降低缺血再灌注后海马区Caspase-3的蛋白表达（p<0.05）。3d时Caspase-3蛋白的升高达高峰，NBP治疗组较再灌注组的表达明显降低（p<0.05）。7d时各组均回落，无统计学意义。
　　 讨论：
　　 丁基苯酞（dl-3n-butylphthalide，NBP）是一种专门用于治疗脑血栓的国家级一类药品，多项研究证明该药对缺血后的脑组织具有保护作用。本实验通过Nissl染色从形态学上可以观察到NBP治疗组沙土鼠海马CA1细胞较缺血再灌注组形态完整，排列较整齐，细胞大而圆，尼氏体深染，锥体细胞的丢失减少。结果表明NBP具有减轻沙土鼠全脑缺血再灌注损伤的作用，与既往实验相符。目前一些研究认为ERK的激活与细胞增殖有关，可促进细胞存活。本实验研究证明，NBP组较缺血再灌注组的p-ERK升高明显（p<0.05），提示NBP可能通过调节p-ERK的表达起到保护脑组织的作用。Caspase-3是凋亡过程中的关键蛋白酶，Caspase-3蛋白含量增加，可引发细胞凋亡。本实验研究证明沙土鼠脑缺血再灌注损伤后应用NBP治疗可明显抑制Caspase-3的升高（P<0.05），说明NBP可通过抑制Caspase-3的活性升高而起到保护脑组织的作用。
　　 结论：
　　 1、NBP可以改善沙土鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区神经细胞的损伤。
　　 2、NBP可以增加沙土鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区p-ERK的表达。
　　 3、NBP可以抑制沙土鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区Caspase-3的表达。

目录

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实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述

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