牙髓卟啉单胞菌脂多糖对成骨细胞膜表面受体的影响

摘要

目的：
　　 牙髓卟啉单胞菌(porphyromonas endodontalis,P.e)是造成牙髓感染和根尖周病的主要致病菌,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是其重要的毒力因子,有很强的致炎作用。在根尖骨组织改建过程中,成骨细胞的生物学行为至关重要。在P.e-LPS作用下,成骨细胞可产生炎症介质白细胞介素6(interleukin6,IL-6)等,IL-6可通过刺激破骨细胞的生成,增加破骨细胞的骨吸收等作用加速骨组织的破坏。本实验旨在观察P.e-LPS诱导炎症因子IL-6表达的细胞膜表面相关受体的变化,揭示P.P-LPS在根尖周骨质破坏中的作用机制。
　　 材料与方法：
　　 1、细菌培养；
　　 应用脑心浸液(Brain heart infusion,BHI)固体培养基在37℃、厌氧条件(含80％N2、10％CO2、10％H2)下复苏培养P.e,BHI液体培养基增菌后收集细菌,-20℃保存。
　　 2、内毒素提取；
　　 采用热酚水法提取P.e-LPS,应用凝胶鲎试剂法对所提取LPS进行定性分析。
　　 3、细胞培养；
　　 小鼠成骨细胞(MC3T3-El)生长于含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的MEM-α培养基中,置于含5％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养。选择生长状态良好的细胞用于实验。
　　 4、RNA提取及RT-PCR；
　　 将10μg/ml的P.e-LPS作用于MC3T3-El细胞培养0、1、3、6、12及24h,收集细胞,提取RNA,RT-PCR法检测CD14、TLR2、TLR4及β-actin的mRNA表达。
　　 5、流式细胞术；
　　 将10μg/ml的P.e-LPS作用于MC3T3-El细胞培养24h,换用无血清培养液,并设置空白组和未加LPS的对照组,收集细胞,流式细胞仪检测CD14、TLR2、TLR4的阳性细胞率。
　　 6、免疫荧光染色
　　 将10μg/ml的P.e-LPS,作用于MC3T3-El细胞培养1h,设置一抗替代空白组和未加LPS的阴性对照组,免疫荧光染色,荧光显微镜下观察CD14、TLR2、TLR4的表达。
　　 7、中和抗体实验；
　　 CD14、TLR2及TLR4抗体预处理MC3T3-E1细胞1h,再用10μg/ml的P.e-LPS作用细胞6h,设置空白组、LPS阳性组和未加LPS的对照组,RT-PCR法检测IL-6和β-actin的mRNA表达。
　　 8、统计学分析；
　　 所有实验数据应用SPSS11.0软件包建立数据库,进行单因素方差分析Dunnett-t检验。显著水平:P＜0.05时有显著性差异,P＜0.01时有高度显著性差异。
　　 结果：
　　 1、P.e-LPS作用于成骨细胞后可诱导其CD14、TLR4 mRNA和蛋白的表达,但不能诱导TLR2表达。
　　 2、免疫荧光染色后可观察到P.e-LPS作用后CD14,TLR4的荧光表达明显增强,而TLR2则无明显变化。
　　 3、CD14和TLR4抗体可部分抑制P.e-LPS诱导的IL-6 mRNA的表达,TLR2抗体无此作用。
　　 结论：
　　 1、P.e-LPS作用于MC3T3-E1细胞可诱导膜表面受体CD14和TLR4增多,但与TLR2无关。
　　 2、P.e-LPS依赖于CD14和TLR4膜受体途径作用于MC3T3-E1细胞,诱导产生IL-6。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述:口腔致病菌的膜表面相关受体的研究

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