胃癌细胞CXCL12启动子异常甲基化导致表达沉默的研究

摘要

目的和意义：
　　 随着研究的不断深入,近几年许多新型趋化因子及其受体基因不断地被发现,人们对于多种趋化因子及其受体的生物学活性和作用机理有了更深入的研究,对趋化因子超家族的结构与功能有了更全面的了解。趋化因子是由不同类型细胞分泌的能使细胞发生趋化运动的低分子质量的细胞因子。趋化因子受体是一类表达于不同类型细胞上的能与趋化因子结合的含有七个跨膜区的G蛋白耦联受体,在正常和非正常生理状况下都起重要作用。
　　 在趋化因子及受体中研究较为成熟的是CXCR4/CXCL12轴。CXCR4/CXCL12轴不仅在正常机体生理调节中具有重要作用,目前研究认为其与恶性肿瘤的发生、发展和转移密切相关。大量的研究证实在多数恶性肿瘤中,肿瘤细胞表面表达有趋化因子的受体CXCR4,转移器官存在着高表达的趋化因子CXCL12,从而使得肿瘤细胞可以受趋化作用,发生器官特异性的转移活动。近来的实验研究发现在结肠癌、乳腺癌肿瘤细胞中趋化因子CXCL12表达下调甚至不表达。而导致CXCL12表达下调的主要原因可能是其启动子发生甲基化,从而抑制了肿瘤细胞内源性趋化因子的表达。
　　 本研究旨在探讨CXCL12在胃癌中的表达情况以及可能的分子调节机制。首先我们在组织水平上检测CXCL12的表达水平,发现胃癌组织中存在CXCL12表达下调的现象,我们通过检测CXCL12启动子区CpG岛甲基化状态分析其是否与CXCL12表达下调相关以及CXCL12表达下调和启动子区异常甲基化与临床病理学特征的关系。研究的第二部分我们进一步通过体外实验研究胃癌细胞株在去甲基化制剂的作用下CXCL12表达是否可以逆转,以及观察去甲基化制剂5-Aza-dC对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响,探讨5-Aza-dC药物调控的意义及治疗胃癌的潜在临床应用价值
　　 实验方法：
　　 一、实验对象
　　 2009年7月～2010年6月中国医科大学附属第一医院肿瘤外科行根治性手术治疗的胃癌患者癌和癌旁组织配对共73例;人胃癌细胞株MGC-803、BGC-823、SGC-7901、HGC-27、AGS、MKN-45和永生化正常人胃细胞株GES1以及人腹膜间皮细胞株HMrSV5。
　　 二、实验方法
　　 1、细胞培养:GES1、MGC-803、BGC-823、SGC-7901、HGC-27、AGS、MKN-45和HMrSV5按常规培养。
　　 2、半定量RT-PCR和定量RT-PCR检测CXCL12基因mRNA在组织和细胞水平的表达。
　　 3、细胞免疫荧光检测8株细胞CXCL12蛋白表达位置。
　　 4、流式细胞仪通过分析平均荧光强度检测8株细胞CXCL12蛋白表达含量。
　　 5、免疫组织化学检测胃癌和癌旁组织中CXCL12蛋白表达水平。
　　 6、甲基化特异性PCR法检测CXCL12基因DNA启动子甲基化状况。
　　 7、去甲基化制剂5-Aza-dC处理CXCL12表达下调的胃癌细胞株。
　　 8、应用阿尔玛蓝检测5-Aza-dC处理后MKN-45细胞活力。
　　 9、应用Transwell侵袭实验检测5-Aza-dC处理后MKN-45细胞侵袭能力变化。
　　 结果：
　　 第一部分胃癌组织CXCL12表达及启动子甲基化的研究
　　 1、免疫组化结果显示CXCL12表达在正常胃粘膜细胞和分化较好的胃癌细胞的细胞浆内。CXCL12蛋白在73例胃癌组织中表达水平(中位数=0.006150,范围=0.000090-0.147000)低于癌旁正常组织(中位数=0.0258000,范围=0.000050-0.227000),差异显著(P＜0.01)。
　　 2、RT-PCR结果显示48例胃癌组织CXCL12mRNA(中位数=0.25515,范围=0.05890-3.13540)表达水平明显低于相应癌旁组织(中位数=0.42860,范围-0.06220-3.97220),差异显著(P＜0.05)。
　　 3、35例胃癌组织中CXCL12基因启动子区甲基化发生率为65.7％,部分甲基化发生率为22.9％,非甲基化率为11.4％。而相应的癌旁正常组织中CXCL12基因启动子区甲基化、部分甲基化、非甲基化发生率分别为11.4％、11.4％、77.1％。CXCL12基因启动子区甲基化发生率显著高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4、胃癌组织CXCL12蛋白表达水平与组织分化程度(P＜0.05)和淋巴结转移情况(P＜0.05)密切相关;CXCL12mRNA表达水平与淋巴结转移情况(P＜0.05)密切相关;而胃癌组织中CXCL12基因启动子区甲基化的发生率与年龄、性别、临床病理分期、肿瘤分化程度等临床病理资料无明显关联(P＞0.05)。第二部分胃癌细胞CXCL12表达及5-Aza-dC诱导CXCL12去甲基化的实验研究
　　 1、细胞免疫荧光实验检测CXCL12表达在GES1、HMrSV5、HGC-27、AGS细胞核周围的胞浆部分。胃癌细胞株CXCL12mRNA和蛋白水平明显低于GES1和HMrSV5,差异均有显著性(P＜0.05),并且高侵袭、高转移能力的细胞SGC-7901、MKN-45CXCL12mRNA和蛋白水平低于其他各胃癌细胞株(P＜0.05)。
　　 2、甲基化特异性PCR检N8株细胞CXCL12启动子甲基化情况,MGC-803、SGC-7901、MKN-45显示CXCL12基因启动子区甲基化;BGC-823、HGC-27、AGS为部分甲基化而GES1、HMrSV5则显示非甲基化。
　　 3、对CXCL12低表达的胃癌细胞株MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45采用去甲基化制剂5-Aza-dC处理。结果显示除BGC-823在作用前后CXCL12表达水平未见明显差异(P＞0.05)外,MGC-803、SGC-7901、MKN-45细胞株在去甲基化制剂作用后mRNA和蛋白水平明显增高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4、去甲基化制剂5-Aza-dC抑制高侵袭、高转移能力的胃癌细胞株MKN-45增殖,降低了MKN-45细胞的侵袭能力。
　　 结论：
　　 1、胃癌组织中存在CXCL12表达下调,且与胃癌淋巴结转移和胃癌分化程度密切相关。
　　 2、CXCL12启动子区CpG岛的异常甲基化可能是胃癌组织CXCL12表达水平下调的机制之一。
　　 3、在人胃癌细胞株亦存在CXCL12表达下调,其中MGC-803、SGC-7901和MKN-45胃癌细胞CXCL12表达下调为启动子区异常甲基化引起,利用去甲基化制剂处理可以逆转CXCL12的表达下调。
　　 4.去甲基化制剂5-Aza-dC可以抑制胃癌细胞MKN-45的增殖,同时也可以降低其侵袭转移的能力。