粘附分子和JNK信号在胸主动脉瘤形成过程中的作用机制

摘要

前言：胸主动脉瘤是一种常见的潜在的致命性血管外科疾病,因发病凶险,死亡率高,严重威胁人民群众生命健康,因此对该病的研究具有极其重要的临床和社会价值。
　　 主动脉瘤是一种多因素疾病,受细胞内和细胞外信号的双重调控,是血管壁细胞种类和数量改变以及细胞外基质病理性重塑的结果。主要病理学改变包括:动脉壁慢性透壁炎症、中膜平滑肌细胞缺失、胶原蛋白和弹力蛋白减少。
　　 炎症在心血管疾病的发生和发展过程中发挥关键性的作用。动脉瘤或动脉粥样硬化均有白细胞的浸润,特别是巨噬细胞和T细胞,进而引起免疫反应和血管病变。浸润的炎症细胞释放许多的炎症因子,同时促进基质金属蛋白酶的产生。目前,有数种分子在炎症级联反应发挥关键作用。其中粘附分子,包括VCAM-1和ICAM-1,在炎症细胞募集过程中发挥重要作用。他们在炎症反应中与白细胞的黏附,滚动和跨内皮迁移相关联。免疫球蛋白样分子ICAM-1在正常内皮细胞呈弱表达,而在暴露于炎症因子的情况下,其表达迅速升高。在白细胞的聚集和黏附过程中,VCAM-1主要通过与单核细胞和淋巴细胞上的反配体VLA-4相作用。MCP-1属于CC趋化因子家族,是单核细胞,T淋巴细胞,自然杀伤细胞和嗜碱粒细胞潜在的激动剂。然而,关于近段胸主动脉炎症疾病的研究很少,充分揭示炎症分子对动脉瘤成瘤的作用,对胸主动脉瘤的治疗是很关键的。
　　 C-Jun氨基末端激酶(JNK),是炎症初期的信号分子,临床和动物实验证实其与腹主动脉瘤和脑动脉瘤的扩张相关。尽管已知JNK参与腹主动脉瘤的形成,但由于胸主动脉和腹主动脉来自不同的胚层,二者动脉瘤发生的机制也有可能不同,本实验通过研究活化的JNK通路在胸主动脉瘤的表达,进一步明确胸主动脉瘤的发病机制。
　　 姜黄素是从姜科植物中提取的一种相对分子量小的多酚类物质。大量研究证明,姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗血栓、抗癌、清除自由基等作用。口服姜黄素可以抑制实验性小鼠腹主动脉瘤的发展。最近有研究报道,姜黄素对缺血再灌注心肌细胞的JNK磷酸化有抑制作用,进而遏制了JNK磷酸化导致的心肌细胞凋亡。然而,姜黄素是否可通过拮抗胸主动脉瘤的JNK信号,从而减少胸主动脉平滑肌细胞凋亡、阻断胸主动脉瘤的成瘤通路,国内外迄今尚未见报道。
　　 因此本项研究分三方面:
　　 1.通过检测促炎性细胞迁移的MCP-1和粘附分子在早期胸主动脉瘤的表达,进一步阐释炎症信号在胸主动脉瘤的形成过程中的作用。
　　 2.通过探索胸主动脉瘤模型大鼠体内JNK信号的变化规律和JNK对细胞基质合成和平滑肌细胞凋亡的调控特点,阐明JNK信号通路在胸主动脉瘤成瘤过程中的作用。
　　 3.通过用姜黄素拮抗JNK通路对胸主动脉瘤进行治疗,评价姜黄素的血管保护作用,阐释姜黄素对动脉瘤的治疗机制。研究的结果为阐述胸主动脉瘤发病机制和逆转方法提供科学依据。
　　 方法：
　　 第一部分:采用大鼠升主动脉狭窄后扩张动物模型为研究对象。应用超声检测仪和SZH立体显微镜观察主动脉管径的变化；应用组织学方法、扫描电镜、免疫组织化学技术、及明胶酶谱分析技术检测胸主动脉瘤形成早期介导炎性细胞迁移的粘附分子和MMP的表达改变。
　　 第二部分:采用胸主动脉周围敷氯化钙诱导的胸主动脉瘤模型为研究对象,应用免疫组化技术检测人及大鼠胸主动脉瘤炎症上游信号JNK通路改变。应用SZH立体显微镜检测动脉管径变化;地衣红和茜素红染色观察动脉结构改变；采用western blot技术、TUNEL技术检测姜黄素对胸主动脉瘤JNK信号通路的抑制及对动脉壁细胞的保护作用。
　　 结果：
　　 一、MCP-1,VCAM-1和ICAM-1在动脉瘤扩张早期的表达
　　 1、Wistar大鼠扩张升主动脉的形态学改变
　　 (1)动脉管径改变术后8周,正常升主动脉无扩张,呈光滑圆管状,动脉瘤可见明显的动脉扩张。动脉瘤组动脉管径较对照组管径增长44.26％(对照组2.35±0.05 mm,动脉瘤组3.39±0.15 mm,p＜0.05)。
　　 (2)动脉瘤壁组织学改变HE染色可见主动脉瘤壁的结构紊乱,伴有大量炎性细胞浸润。Romeis地依红染色可见正常升主动脉壁的弹力板排列规则、紧密,弹力板呈现连续状态;升主动脉瘤壁的弹力板排列混乱、各层之间间隔增大,并有断裂现象。有时断裂部位有炎性细胞浸润。
　　 2、CD45,MCP-1,ICAM-1和VCAM-1在动脉瘤的表达
　　 (1)正常动脉管壁CD45阳性细胞仅在血管壁内膜有少量表达；相反,动脉瘤管壁的全层均可见CD45阳性细胞。
　　 (2)MCP-1,ICAM-1和VCAM-1在正常升主动脉仅有少量表达,动脉瘤MCP-1表达明显增强,主要定位于管壁内膜。VCAM-1主要定位于动脉瘤管壁内膜增厚的内皮细胞层。ICAM-1集中定位于动脉瘤管壁内皮,同时在中膜和外膜有大量散在的阳性染色。动脉瘤管壁MCP-1,ICAM-1和VCAM-1平均光密度较对照组显著升高。
　　 3、MMP-2和MMP-9的表达正常动脉壁中的明胶酶活性很低,没有显示出降解条带;动脉瘤时动脉壁中MMP-2、MMP-9的活性和表达较正常动脉显著升高。
　　 二、JNK信号在胸主动脉瘤形成中的机制
　　 1、胸主动脉瘤JNK信号表达人胸主动脉瘤组织p-JNK高表达,主要位于中膜,外膜少量表达。对Wistar大鼠胸主动脉瘤模型的JNK及其下游底物p-c-jun进行检测,发现动脉瘤的p-JNK和p-c-Jun阳性细胞较正常动脉明显增多。
　　 2、姜黄素对动脉瘤管径的影响正常胸主动脉无扩张,氯化钙处理的胸主动脉显著扩张,形成动脉瘤。而姜黄素治疗组胸主动脉扩张程度较胸主动脉瘤组明显降低,几乎接近正常动脉管径的水平。
　　 3、姜黄素对动脉瘤管壁弹力板和钙沉积的影响(1)动脉瘤组动脉壁的弹力板较正常动脉的层数减少、变得平直。而用姜黄素治疗组,动脉壁的弹力板层数目较动脉瘤组明显增多。形态上也同正常动脉相似,呈波浪型膜状。(2)茜素红染色可见应用氯化钙处理的动脉壁周围有大量钙的沉积,在动脉壁钙沉积的部位血管呈现出局部扩张明显,而姜黄素组动脉周围几乎没有钙的沉积。
　　 4、姜黄素对JNK信号的抑制作用正常主动脉壁p-JNK仅有少量表达,而在动脉瘤壁中显著升高。用姜黄素治疗后由于下调了p-JNK的表达,使p-JNK的表达水平与正常水平接近。同时JNK的下游底物p-c-jun与p-JNK表达的结果相一致。动脉瘤壁中p-c-jun较正常动脉升高,姜黄素治疗组则明显下调p-c-jun的表达。
　　 5、姜黄素对动脉瘤管壁的细胞凋亡影响正常动脉壁几乎没有凋亡细胞存在,用CaCl2造模的动脉瘤组TUNEL阳性细胞增多,表明有显著的动脉瘤壁平滑肌细胞凋亡。用姜黄素治疗组TUNEL阳性细胞出现率较动脉瘤组显著降低。证明姜黄素可显著降低动脉瘤管壁的细胞凋亡。
　　 6、姜黄素对bcl-2,baX和caspase-3表达水平的影响
　　 (1)随凋亡的增加,动脉瘤组伴出现bax表达升高,bcl-2表达降低,bcl-2/bax的比值较正常组下降现象。
　　 (2)与动脉瘤组相比,姜黄素治疗组则上调了bcl-2/bax的比值。
　　 (3)检测结果证明caspase-3在动脉瘤组也呈现明显的高表达,而应用姜黄素治疗后,其表达水平也显著降低。
　　 结论：
　　 1、MCP-1,ICAM-1,VCAM-1,MMPs的表达及炎性细胞的浸润与胸主动脉瘤早期扩张相关,这些炎症因子在动脉扩张早期发挥重要作用,这一发现进一步证明炎症因子确实参与胸主动脉瘤的成瘤过程。
　　 2、JNK信号在动脉瘤细胞外基质重构和平滑肌细胞凋亡过程中发挥重要作用。
　　 3、姜黄素能够拮抗JNK及其下游底物c-jun的磷酸化并减少动脉管壁细胞凋亡。姜黄素对主动脉的病理性扩张和成瘤过程具有抑制作用,是一种较好的血管保护药。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

论文一、MCP-1,VCAM-1和ICAM-1在动脉瘤扩张早期的表达

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二、JNK信号在胸主动脉瘤形成中的机制探讨

前言

第一部分:JNK在胸主动脉瘤的表达

材料与方法

实验结果

第二部分:姜黄素通过拮抗JNK信号和抑制凋亡对胸主动脉瘤的治疗作用

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述:TGF-β信号通路与主动脉瘤的研究进展

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致谢

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