激烈热球菌胞外α-淀粉酶的体外定向进化

摘要

α-淀粉酶，按酶委会(Enzyme Commission)的标准为EC3．2．1．1，是指一类作用于淀粉分子，从分子内部切开α-，4键，生成糊精和还原糖的水解酶，产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故称α-淀粉酶。目前淀粉糖生产工业主要应用的是耐高温α-淀粉酶，多为BLA(Bacillus Licherliformis α-amylase)，但BLA最适pH值(6.0)较高，需要添加Ca<'2+>。近年研究发现PFA(Pyrococcus furiosusextracellular α-amylase)活性不依赖于Ca<'2+>，具有极大的工业应用潜力。本文以激烈热球菌胞外α-淀粉酶(PFA)为研究对象，用易错PCR的方法构建PFA基因随机突变文库，库容量约为10000，在96孔板中，以3，5-二硝基水杨酸为显色剂，测定不同pH值条件下的酶活力，肉眼直接观察显色结果，筛选得到一株突变体(muta)，经过测序和序列比对发现全序列435个氨基酸中，只有一个氨基酸发生改变，即第31位由精氨酸变为甘氨酸，该位点位于酶分子结构域A的第一个α-螺旋中，三维结构模拟显示酶分子表面极性发生明显改变。突变体最适pH降低约0.5个单位，比酶活提高5倍以上。本实验为从分子结构上阐释PFA的嗜酸机理提供部分理论研究基础，突变体的酶学性质更接近工业应用的需要，提高了PFA的工业应用潜力。

目录

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摘要

第一章前言

1.1分子体外定向进化的研究方法

1.1.1构建突变文库的常用策略

1.1.2筛选策略

1.1.3 应用

1.2耐高温α-淀粉酶的分子结构和催化机理

1.2.1耐高温α-淀粉酶的种类

1.2.2耐高温α-淀粉酶的分子结构

1.2.3 α-淀粉酶的催化机理

1.2.4 α-淀粉酶定向进化的研究进展

1.2.5 α-淀粉酶的工业应用

1.3 PFA的研究进展

第二章材料与方法

2.1材料与仪器

2.1.1材料

2.1.2仪器

2.2方法

2.2.1引物

2.2.2易错PCR

2.2.3易错PCR产物回收

2.2.4载体和片段的限制性酶切

2.2.5载体和片段的连接

2.2.6电转化

2.2.7酶活测定

2.2.8诱导表达

2.2.9筛选方法

2.2.10包含体纯化

第三章结果与分析

3.1载体和模板电泳检测

3.2 pET 28a(+)双酶切(EcoR1 Nhe1)

3.3易错PCR

3.4酶切产物回收

3.5连接效果检测

3.6筛选结果

3.7蛋白表达结果

3.8蛋白纯化结果

3.8.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.8.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.8.3酶分子二聚体变性电泳

3.9突变体酶学性质测定

3.9.1最适pH值

3.9.2相对酶活

3.9.3最适温度

3.9.4温度稳定性

第四章讨论

4.1野生型PFA及突变体的一级结构特征

4.2野生型PFA和突变体的二级结构比较

4.3野生型PFA和突变体的三级结构比较

4.4野生型PFA和突变体在突变点附近分子表面结构比较

第五章结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表文章