TRPM7在压力超负荷下小鼠心肌纤维化形成中的作用

摘要

高血压(Hypertension)是最常见的心血管疾病，由于发病率较高已成为全球范围重要的公共健康问题。长期高血压的患者会发生代偿性的心肌肥厚(Cardiachypertrophy)，最终导致心功能障碍和心力衰竭，其发生与心肌重构(Myocardialremodeling，MR)密切相关。临床观察和实验室研究证明，心肌纤维化(Myocardialfibrosis)是心肌重构的重要病理表现之一，也是造成心力衰竭的主要原因。因此，明确心肌纤维化的发生机制，将有利于寻找新的治疗靶点，对临床防治心脏疾病具有重要意义。
　　 心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts，CFs)是心肌纤维化产生的细胞学基础。在某些病理因素如心肌损伤、缺氧应激、机械牵拉、炎性刺激等作用下，心肌成纤维细胞会过度增殖、迁移和发生表型转变，分化成为肌纤维母细胞(Myofibroblasts，MFB)。肌纤维母细胞通过分泌细胞外基质蛋白(Extracellular-matrix，ECM)、生长因子、细胞介素、趋化因子和蛋白酶等，对纤维化的形成起着重要作用。然而，关于调控心肌成纤维细胞分化，进而促进纤维化形成的分子机制还不清楚。
　　 Ca2+信号参与细胞的多种功能，包括细胞的增殖、分化、基因表达、细胞的凋亡等。研究表明，在心肌成纤维细胞上并不存在功能性电压依赖性Ca2+离子通道，这与其静息膜电位(-20 mV)下电压门控离子通道处于失活状态有关，提示非电压门控的Ca2+通道可能对心肌成纤维细胞的生理功能起主导作用。瞬时感受器电位(Transient receptor potential，TRP)通道是近年来发现的非电压门控性离子通道，能被多种刺激所激活，包括氧化应激、机械牵拉、细胞代谢产物、热刺激等。TRPM7(Transient receptor potential melastatin related7)通道是TRP家族成员之一，广泛存在于机体的组织器官中，参与细胞的增殖和分化、运动和迁移、胚胎的发育、氧化应激反应以及细胞的凋亡等。最近的研究发现，在人类心房肌成纤维细胞上，TRPM7通道是对Ca2+通透的主要的功能性离子通道，并且参与心房肌成纤维细胞的增殖、分化和胶原的生成。由此我们推测，TRPM7可能参与心肌成纤维细胞的促纤维化作用。
　　 转化生长因子-β1(Transforming growth factor beta-1，TGF-β1)是体内促进心肌纤维化的重要细胞因子之一，研究表明，TGF-β1具有促进心肌成纤维细胞向肌纤维母细胞分化、促进胶原基因表达、ECM合成与沉积等作用。而细胞内Ca2+信号是TGF-β1信号转导通路中重要的第二信使，使用Ca2+通道阻滞剂能够部分抑制TGF-β1介导的心肌纤维化形成。TRPM7通道作为心肌成纤维细胞上主要的功能性Ca2+离子通道，很可能与TGF-β1介导的心肌纤维化过程相关联。
　　 神经鞘脂类(Sphingolipids)分子是细胞膜的一个重要组成成分，同时在细胞的信号转导过程中发挥着重要作用。神经鞘脂类分子主要包括神经酰胺(Ceramide，Cer)、神经鞘氨醇(Sphingosine，SPH)、1-磷酸神经鞘氨醇(Sphingosine1-phophate，S1P)等。它们参与细胞的多种生物学过程，被称作“具有生物活性的脂类”。最新的研究发现，某些神经鞘脂类分子对TRP通道家族中的一些成员具有调节作用。因此我们推测神经鞘脂类分子可能对TRPM7通道也有调节作用。
　　 为明确心肌纤维化的发生机制，本研究通过主动脉弓缩窄术(Transverse AorticConstriction，TAC)模拟和建立压力超负荷(高血压)致小鼠心肌纤维化模型，采用心脏超声、免疫组织化学方法、电生理学方法、钙比率荧光成像技术以及基因敲除等多种分子生物学技术，探讨TRPM7在心肌纤维化形成中的作用和潜在的分子机制以及内源性的神经鞘磷脂分子及其结构类似物对TRPM7通道活性的影响，以期为临床上心肌纤维化的治疗寻求新的干预靶点和新药开发提供实验依据。
　　 实验材料和方法
　　 将20只雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄)随机分为TAC模型组和假手术组，每组10只，运用心脏超声监测各实验条件下小鼠心功能变化情况。于术后8周处死小鼠切取心脏，检测心脏及肺脏的重量，计算心脏肥厚指数和肺重量指数。通过HE染色方法观察心脏结构变化；采用苦味酸.天狼猩红胶原染色(Picro-siriusred)检测心肌纤维化程度并计算心肌胶原容积分数(Cardiac collegen volumefraction，CVF)；通过Western blot检测心肌组织中TRPM7蛋白表达水平。
　　 另将20只TRPM7基因敲除(TRPM7-/-)小鼠和20只野生型(WT)小鼠分别随机分为TAC模型组和假手术组，即TRPM7-/-TAC组、TRPM7-/-Sham组、WT-TAC组和WT-Sham组，每组10只。分离和培养小鼠心室肌成纤维细胞，采用钙比率荧光显像技术测量WT模型组和WT假手术组小鼠心肌成纤维细胞内Ca2+浓度；膜片钳(全细胞)检测心肌成纤维细胞TRPM7通道电流变化。在通过PCR方法和Western Blot方法确认TRPM7基因敲除的基础上，运用前述的相关实验方法检测各组小鼠心肌肥厚和心功能变化情况、心肌纤维化程度、TRPM7蛋白及TGFβ1蛋白表达水平。
　　 以稳定高表达TRPM7通道的293-TRPM7细胞和人类及小鼠心肌成纤维细胞为研究对象，通过膜片钳技术检测内源性的神经鞘脂类分子及其结构类似物一神经鞘氨醇(SPH)、1-磷酸神经鞘氨醇(S1P)、神经酰胺(Ceramide)、二甲基鞘氨醇(DMS)和芬戈莫德(FTY720)等对TRPM7通道活性的影响。
　　 结果
　　 1、术后8周，超声心动图结果显示：TAC组小鼠左心室壁厚度、左室内径均显著高于Sham组(P<0.01)；左室射血分数和缩短分数均明显低于Sham组(P<0.01)。HE染色显示：TAC组小鼠心肌细胞体积明显增大，心肌细胞间距明显增宽，心肌肥厚指数显著增加(P<0.01)。苦味酸.天狼猩红心肌胶原染色显示：TAC组小鼠心肌胶原容积分数明显升高(P<0.01)。Western Blot方法检测结果显示：TRPM7通道蛋白在TAC组小鼠纤维化心肌中表达上调(P<0.05)。
　　 2、术后8周，与WT-Sham组相比，WT-TAC组小鼠心肌成纤维细胞的Ca2+内流显著增加(P<0.05)、同时检测到TRPM7通道电流幅度明显增大(P<0.05)。与WT-TAC组相比，TRPM7-/-TAC组小鼠心肌肥厚程度减轻，心脏泵功能也明显强于WT-TAC组(P<0.01)。TRPM7-/-TAC组小鼠心肌组织中胶原形成减少，并且其心肌成纤维细胞TGFβ1蛋白表达量也减少。
　　 3、细胞外液分别灌流1μM的SPH、DMS和FTY720能够完全阻断HEK-293细胞的TRPM7通道电流，其IC50分别为0.59μM、0.3μM和0.72μM；而鞘磷脂分子Ceramides、SIP和SPH结构类似物FTY720-P对TRPM7通道的活性无明显作用。同样，SPH、DMS和FTY720对TRPM7通道电流的抑制作用在人类心房肌成纤维细胞和小鼠心肌成纤维细胞上也得到证明。
　　 结论
　　 1、在采用主动脉弓缩窄术(TAC)制作的压力超负荷小鼠模型中，检测出心脏泵功能减弱，出现了心室肌肥厚、心肌纤维化。
　　 2、TRPM7通道蛋白在小鼠纤维化心肌中表达水平升高。TRPM7通道可能通过增强介导Ca2+内流，促进心肌纤维化的形成。其中，调节心肌成纤维细胞TGF-β1表达是其作用机制之一。
　　 3、研究证实，TRPM7基因敲除后能降低压力超负荷下心肌肥厚及纤维化的程度，减小心脏泵功能的损伤。
　　 4、SPH、DMS和FTY720能够抑制TRPM7通道活性，其作用具有剂量依赖性。