藤黄微球菌AD3的阿特拉津降解基因分析与降解特性研究

摘要

阿特拉津是一种三嗪类除草剂，用于阔叶类杂草的防除，其生物毒性来自于其分子中的一个氯原子。将阿特拉津完全降解成二氧化碳和水需要六步降解反应，其中降解途径中第一个酶为阿特拉津氯水解酶(AtzA)或三嗪水解酶(TrzN)，其用途是催化阿特拉津水解脱氯，生成无毒的羟基阿特拉津。 本研究从河北省宣化农药厂的阿特拉津工业废水中分离出一株阿特拉津降解细菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)AD3，在前人研究的基础上，通过AD3菌株的分子杂交，核苷酸序列测定，质粒检测，生物修复等方法对它的降解特性等进行了研究，首先以AD3菌株总DNA为模板，进行分子杂交，结果显示AD3不具有通常大多数降解菌株含有的atzA，但具有atzD，说明AD3可能具有trzN和降解途径的后三个基因。因此，我们以节杆菌TC1的trzN的基因为参考序列，设计PCR引物，通过PCR扩增，得到trzN基因中心区片段，并将PCR产物直接测序，通过与TC1菌株的trzN基因中心区片段做同源性比较，发现AD3菌株和TC1菌株的trzN核心区的同源性达到100％，同时还参照ADP菌株的atzB,atzC，atzD，atzE, atzF设计引物，通过对atzB,atzC的序列结果和atzD，atzE,atzF的PCR结果分析表明，AD3具有降解阿特拉津的全套基因，能够完全降解阿特拉津。通过对其生长特性的试验表明，它的降解性能大大超过文献报道的假单胞菌ADP，并且AD3菌株利用碳源和氮源的物质广泛，具有较好的应用价值。质粒分析显示AD3具有同ADP大小相似的大质粒，但阿特拉津降解基因是否位于这个大质粒上，需要进一步的实验去验证。 除此之外，还将AD3应用于阿特拉津工业废水的生物修复实验，结果显示，单独用AD3可以除去部分废水中的阿特拉津，去除率为42.3％，将物理化学方法和生物法联合使用，可有效去除废水中的阿特拉津，去除率达到82.5％。

目录

声明

摘要

前言

第一章综述

1.1除草剂阿特拉津的性质

1.2除草剂阿特拉津的使用所带来的环境问题

1.3阿特拉津生物降解概述

1.3.1植物修复

1.3.2微生物修复

1.4细菌降解阿特拉津的机制

1.4.1阿特拉津降解的氯水解途径

1.4.2阿特拉津降解基因的质粒遗传

1.5阿特拉津降解基因的应用

第二章藤黄微球菌(Micrococcus luteus)AD3的分子杂交

2.1材料

2.1.1菌株

2.1.2试剂

2.1.3仪器

2.2方法

2.2.1细菌总DNA的制备

2.2.2探针的制备

2.2.3 PCR产物的纯化

2.2.4点膜

2.2.5杂交

2.2.6曝光及显影

2.3结果

2.4本章小节

第三章藤黄微球菌(Micrococcus luteus)AD3的PCR检测

3.1材料

3.1.1酶类与试剂

3.1.2培养基

3.2方法

3.2.1细菌总DNA的制备

3.2.2 PCR扩增

3.2.3 PCR产物的纯化

3.2.4 PCR产物与载体的连接

3.2.5 E.coli DH5α感受态细胞的制备和重组质粒的转化

3.2.6重组质粒提取

3.2.7重组质粒的检测和酶切鉴定

3.2.8核苷酸序列测定

3.3结果

3.4本章小结

第四章藤黄微球菌(Micrococcus luteus)AD3的质粒检测

4.1材料

4.1.1培养基

4.1.2试剂

4.2方法

4.2.1培养条件

4.2.2提取方法

4.3结果

4.4本章小结

第五章藤黄微球菌(Micrococcus luteus)AD3菌株对氰尿酸的降解特性研究

5.1材料

5.1.1培养基

5.1.2微量元素储液

5.2方法

5.3结果

5.4本章小结

第六章藤黄微球菌(Micrococcus luteus)AD3对工业废水的生物修复

6.1材料

6.1.1 atz无碳氮源培养基(g/L)

6.1.2微量元素储液

6.2 AD3的碳源和氮源利用特性鉴定

6.2.1方法

6.2.2 AD3菌株利用碳源和氮源的情况

6.2.3阿特拉津降解菌株的降解效果

6.3阿特拉津高效降解菌用于工业废水的生物修复

6.3.1生长条件实验和阿特拉津去除实验

6.3.2 AD3接菌量对工业废水中阿特拉津去除效果的影响

6.3.3生物处理时间对阿特拉津去除效果的影响

6.3.4物理化学法与生物法连用

结论

参考文献

致谢

攻读学位论文期间发表文章