IL-21对HIV感染者调节性T细胞的作用研究

摘要

目的
　　 艾滋病(AIDS)又名获得性免疫缺陷综合症(Acquiredimmunedeficiencysyndrome),是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的一种严重传染病。高效抗逆转录病毒治疗(highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART)虽然能降低病毒载量,延缓HIV感染的疾病进程,但治疗后部分患者免疫重建不佳。如何有效恢复T细胞的功能,增强机体免疫系统的抗病毒能力,对于HIV感染免疫治疗及疫苗研究具有重要意义。
　　 白细胞介素-21(IL-21)是共用γ链(γc)细胞因子的新成员,在免疫应答中发挥重要作用。在HIV感染中,IL-21可显著增加CD8+T细胞穿孔素及粒溶素等抗病毒功能,更重要的是,其发挥功能的同时,不加重机体的免疫激活,对增强抗HIV免疫应答,抑制免疫活化及免疫重建具有重要意义,被认为是有希望应用到HIV感染临床治疗及疫苗佐剂研究的重要因子。IL-21的临床治疗发展的最大障碍,亦是决定因素,在于IL-21所带来的免疫效应能否转化为病死率和发病率的降低,能否改善疾病的转归。例如,在应用IL-2治疗HIV感染者的临床实验中,尽管CD4+T细胞的数量显著增加,但由于IL-2能扩增Treg亚群,导致免疫功能受到抑制,患者存活率没有改善。调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)抑制免疫激活,也抑制免疫细胞功能,是免疫系统的重要调节因子之一。细胞因子对Treg的影响在其应用于HIV感染治疗及疫苗中不可忽视,明确IL-21对HIV感染者Treg的影响对其应用具有重要意义。HIV感染中,IL-21对Treg的直接影响尚无报道,明确其对Treg的影响对其在HIV感染治疗中的应用具有重要意义。作为共用γc细胞因子家族的成员,IL-7及IL-15在肿瘤的临床治疗中发挥作用,亦应用到HIV感染治疗,但其对Treg的影响研究结果尚不一致。HIV感染中,IL-7及IL-15对Treg的直接影响尚无报道,IL-21对Treg影响与IL-2、IL-7及IL-15作用的差别亦无报道。
　　 本研究对HIV感染者IL-21及Treg在疾病进展中的变化进行研究,并分析IL-21对Treg凋亡,增殖及其效应分子CTLA-4和TGF-β的影响,与其它共用γc细胞因子作用对比,明确HIV感染者IL-21与Treg的相关性及IL-21等共用γc细胞因子对Treg的影响,为进一步明确HIV的致病机制及艾滋病的免疫治疗提供线索。
　　 方法
　　 1、研究对象
　　 58例无症状HIV慢性感染者(HIV)均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊,感染途径多为男男性接触,感染时间一年以上,在检测时间点均未接受HAART治疗(检测发现CD4+T细胞数量低于350个/ul或出现艾滋病指征性疾病均接受治疗)。25例健康对照为随机抽取的HIV抗阴性、未暴露于HIV的健康人(NC),HIV及NC组年龄、性别经检验均无显著性差异。本研究内容获得参加者的书面知情同意。
　　 2、Treg细胞比例、绝对值检测
　　 两管1×106PBMC中加入anti-CD3-PerCP、anti-CD4-APC-CY7、anti-CD25-PE-CY7及anti-CD3-PerCP、anti-CD4-APC-CY7、anti-CD25-PE-CY7、anti-CD127-APC标记的荧光抗体,冰上避光染色,洗涤细胞,前一管按Foxp3细胞破膜染色试剂盒标准操作进行细胞破膜、胞内染色(anti-FoxP3-APC标记的荧光抗体),洗涤并固定细胞。使用BDLSRⅡ流式细胞仪及BDFACSDivaTM软件检测并分析Treg细胞占CD4+T细胞的比例,计算其与该样本的CD4+T细胞绝对值检测结果的乘积即得到Treg细胞绝对数量。
　　 3、CD4+IL-21+T细胞检测
　　 提取PBMC,与PMA、Ionomycin及GolgiStop共培养6小时。用PBS沈涤PBMC后,加anti-CD3-PerCP及anti-CD8-FITC,避光染色,用PBS洗涤后,细胞破膜,加anti-IL-21-PE,避光染色,洗涤细胞后,固定细胞,FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC、CD3-PerCP、CD8-FITC定义CD4+T细胞(CD3+CD8-T细胞),分析IL-21的表达。
　　 4、CD4+CD25+CD127low/-Treg及CD4+、CD8+T细胞增殖
　　 提取人PBMC,用2uMCFSE标记PBMC,用重组IL-21、IL-2、IL-7、IL-15及anti-CD3刺激培养5天,anti-CD3-PerCP、anti-CD4-APC-CY7、anti-CD25-PE-CY7、CD127-APC标记的荧光抗体冰上避光染色,洗涤,流式检测CD4+CD25+CD127low/-Treg及CD4+、CD8+T细胞增殖。
　　 5、CD4+CD25+CD127low/-Treg及CD4+/CD8+T细胞凋亡
　　 提取人PBMC,用重组IL-21、IL-2、IL-7、IL-15及anti-CD3刺激培养3天,anti-CD3-APC-CY7、anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE-CY7、CD127-APC标记的荧光抗体冰上避光染色,洗涤,之后加入anti-AnnexinV-PE及anti-7-AAD,室温避光染色,流式检测CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞及CD4+/CD8+T细胞上AnnexinV及7-AAD的表达量,1h内检测完成。
　　 6、CD4+CD25+CD127low/-Treg上CTLA-4的表达
　　 提取人PBMC,用重组IL-21、IL-2、IL-7、IL-15及anti-CD3刺激培养3天,anti-CD3-PerCP、anti-CD4-APC-CY7、anti-CD25-PE-CY7、CD127-APC标记的荧光抗体冰上避光染色,洗涤,细胞破膜,加anti-CTLA-4-PE,避光染色,洗涤细胞后,细胞固定,FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。
　　 7、CD4+CD25+CD127low/-Treg的TGF-β分泌
　　 提取人PBMC,用重组IL-21、IL-2、IL-7、IL-15及anti-CD3刺激培养5天,于收获前10小时加入Golgistop,收获并染色,anti-CD3-PerCP、anti-CD4-APC-CY7、anti-CD25-PE-CY7、CD127-APC/PE标记的荧光抗体冰上避光染色,沈涤,细胞破膜,分别加anti-TGF-β-PE,避光染色,洗涤细胞后,固定细胞,FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。
　　 8、CD4+T细胞绝对值及病毒载量检测
　　 CD4绝对值依据1997年美国CDC关于HIV感染者CD4+T细胞检测指导方法,应用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式细胞仪MULTISET软件检测。病毒载量采用Roche公司COBAS(R)AmpliPrep(R)/COBAS(R)TaqMan(R)System自动载量仪上以实时荧光定量PCR方法测定病毒载量。全部操作按照操作说明书进行。检测范围为40-10E7拷贝/ml。
　　 9、统计学分析
　　 应用SPSS17.0软件包进行统计分析,数据以MeanwithSEM表示,两组间实验指标的比较采用Mann-WhimeyU检验两组间的差异性,相关性分析采用Spearman秩相关检验,相关的两组之间的比较用两配对样本检验(Wilcoxon),P＜0.05为有统计学意义。
　　 实验结果
　　 一、HIV感染者CD4+IL-21+T细胞水平及其与Treg细胞相关性
　　 58.82%HIV感染者可检测到CD4+IL-21+T细胞,41.18%HIV感染者未检测到CD4+IL-21+T细胞。以病毒载量分组,发现HIV感染组中病毒载量低于20000拷贝/mL组CD4+IL-21+T细胞百分比(1.27±1.55%)及绝对值(5.30±7.81cells/ul)显著高于病毒载量高于20000拷贝/mL组(P=0.021;P=0.017)。未检测到CD4+IL-21+T细胞的HIV感染者CD4+CD25+T细胞百分比显著下降(P=0.020)。HIV感染者CD4+IL-21+T细胞百分比与CD4+CD25+T细胞百分比呈正相关(r=0.463,P=0.006),CD4+IL-21+T细胞绝对值亦与CD4+CD25+T细胞绝对值、CD4+CD25+CD127low/-Treg绝对值及CD4+CD25+Foxp3+Treg绝对值呈正相关(r=0.360,P=0.037;r=0.465,P=0.001;r=0.419,P=0.019)。
　　 二、IL-21等γc链细胞因子对Treg凋亡、增殖及效应分子表达的影响
　　 我们首先研究了IL-21等γc链细胞因了对HIV感染者及健康对照Treg凋亡及增殖的影响。HIV感染者外周血PBMC在IL-21、IL-2、IL-7及IL-15作用下,Treg凋亡(annexinv+7-AAD+)百分比显著低于未刺激对照(P=0.036;P=0.021;P=0.012;P=0.012);Treg增殖百分比显著高于未刺激对照(P=0.041;P=0.002;P=0.006)。健康人外周血PBMC在IL-7和IL-15作用下,Treg凋亡(annexinv+7-AAD+)百分比显著低于未刺激对照(P=0.028;P=0.046),Treg增殖百分比显著高于未刺激对照(P=0.025;P=0.050)。我们发现IL-21、IL-2、IL-7及IL-15影响HIV感染者Treg凋亡及增殖的变化有大于健康人Treg变化的趋势,其中IL-2的作用达到统计学意义(P=0.018)。
　　 我们又进一步研究了IL-21等γc链细胞因子对Treg表达CTLA-4及TGF-β分泌的影响。HIV感染者外周血PBMC在IL-21,IL-2、IL-7及IL-15作用下,Treg的CTLA-4表达及TGF-β分泌有高于未刺激对照的趋势,其中IL-21诱导Treg的CTLA-4表达显著增加(P=0.011),IL-2和IL-15作用下,Treg的TGF-β分泌显著高于未刺激对照(P=0.007;P=0.005)。健康人外周血PBMC在IL-21、IL-7及IL-15作用下,Treg的CTLA-4表达显著高于未刺激对照(P=0.046;P=0.046;P=0.028)。我们发现IL-21、IL-2、IL-7及IL-15诱导HIV感染者Treg的CTIA-4表达及TGF-β分泌的变化有大于健康人Treg效应分子表达变化的趋势,但未达统计学意义。
　　 三、IL-21等γc链细胞因子对T细胞凋亡及增殖的影响
　　 IL-21等γc链细胞因子对CD4+T细胞凋亡及增殖的影响:HIV感染者外周血PBMC在IL-21、IL-7及IL-15作用下,CD4+T细胞凋亡(annexinv+7-AAD+)百分比显著低于未刺激对照(P=0.011;P=0.017;P=0.017);在IL-7及IL-15作用下,CD4+T细胞增殖百分比显著高于未刺激对照(P=0.001;P=0.011)。健康人外周血PBMC在IL-7和IL-15作用下,CD4+T细胞增殖百分比显著高于未刺激对照(P=0.003;P=0.004)。我们发现IL-21、IL-2、IL-7及IL-15抑制HIV感染者CD4+T细胞凋亡的变化有大于健康人CD4+T细胞凋亡变化的趋势,其中IL-7及IL-21作用达到统计学意义(P=0.003;P=0.02);IL-21、IL-2、IL-7及IL-15诱导HIV感染者CD4+T细胞增殖的变化有低于健康人CD4+T细胞增殖变化的趋势,其中IL-2作用达到统汁学意义。(P=0.031)。
　　 IL-21等γc链细胞因子对CD8+T细胞凋亡及增殖的影响:HIV感染者外周血PBMC在IL-21、IL-2、IL-7及IL-15作用下,CD8+T细胞增殖百分比显著高于未刺激对照(P=0.010;P=0.001;P=0.001;P=0.03);在IL-2l、IL-7及IL-15作用下,CD8+T细胞凋亡(annexinv+7-AAD+)百分比显著低于未刺激对照(P=0.012;P=0.012;P=0.012);健康人外周血PBMC在IL-21、IL-2、IL-7及IL-15作用下,CD8+T细胞增殖百分比显著高于未刺激对照(P=0.005;P=0.003;P=0.003;P=0.037)。我们发现IL-21、IL-2、IL-7及IL-15抑制HIV感染者CD8+T细胞凋亡的变化有大于健康人CD8+T细胞凋亡变化的趋势,其中IL-15及IL-21作用达到统计学意义(P=0.005;P=0.005);IL-21、IL-2、IL-7及IL-15诱导HIV感染者CD8+T细胞增殖的变化有低于健康人CD8+T细胞增殖变化的趋势,其中IL-2、IL-7及IL-15作用达到统计学意义(P=0.019;P=0.011;P=0.033)。
　　 结论
　　 HIV感染者CD4+IL-21+T细胞与Treg细胞百分率及绝对值正相关,IL-21促进Treg存活及诱导Treg表达CTLA-4,但不促进Treg细胞增殖及TGF-β分泌。IL-7和IL-15显著促进HIV感染者Treg细胞的增殖,且促进其存活,但不增加Treg效应分子的表达。提示IL-21、IL-15及IL-7在临床应用时需要考虑其对Treg的影响。