戒烟对长期吸烟诱发肺气肿模型气道炎症转归的影响及机制研究

摘要

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系统的常见病，预计到2020年，COPD将成为全球主要死因的第3位[1]。吸烟被证实是COPD最危险的致病因素，所有吸烟者的肺部均发生炎症反应，但是吸烟COPD者肺部炎症反应增强并且持续发展最终导致持续性气流受限[2-3]，戒烟是目前可以预防和延缓肺功能下降的最有效治疗手段，但是COPD患者戒烟后气道炎症反应长时间持续[4]。
　　COPD肺部过度放大并且持续进展的炎症反应的特点，提示炎症反应调节机制异常，研究发现COPD患者的小气道壁周围和肺间质内天然免疫细胞（巨噬细胞、中性粒细胞等）和获得性免疫细胞的浸润明显增加[5-7]，并且随着COPD病情的进展，伴随淋巴滤泡形成的气道数明显增加[8-10]，提示特异性抗原诱导的获得性免疫应答参与了COPD病程的进展，COPD可能是一种自身免疫性疾病;而自身免疫性肺气肿动物模型的建立[11]，说明该疾病的的发生过程包括天然和获得性免疫应答成分，香烟烟雾损伤上皮细胞和细胞外基质，被天然免疫细胞识别，诱导炎性介质的产生，进一步激活中性粒细胞和肺泡巨噬细胞，分别产生弹性蛋白酶(NE)和基质金属蛋白酶-12(MMP-12)[12]，降解弹性蛋白;经过特异性细胞（巨噬细胞、树突状细胞）呈递抗原诱导获得性免疫细胞（T、B淋巴细胞）活化增殖并趋化到病变组织部位产生免疫效应;有学者认为COPD是从非特异炎症过程向获得性免疫过程发展，而这种异常的获得性免疫主要是由于免疫细胞的选择、调节异常，或者是产生了新的抗原[13]。那么，戒烟后肺内免疫细胞的选择和募集，以及参与免疫调节的炎性介质会如何变化，对探讨戒烟后持续气道炎症反应的发生机制有重大意义。
　　肺泡巨噬细胞在天然和获得性免疫应答中发挥重要作用，并且具有显著的异质性和多种生物学功能，包括噬菌、杀菌、促炎或抗炎作用等。另外，还可通过分泌细胞因子、共刺激分子和抗原提呈等途径发挥特异性和非特异性免疫调节功能[17-19]。近年不同的巨噬细胞亚型已被证实，前炎性或者是经典激活巨噬细胞(M1)，可在辅助性T细胞1型(Th1)分泌细胞因子（γ-干扰素和肿瘤坏死因子）环境中被细菌脂多糖(LPS)及炎性物质和/或微生物激活。通过分泌NO和促炎性细胞因子、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1（IL-1）和IL-6等，表现出前炎性和细胞毒活性，可以清除细胞内病原体，同时还可以分泌IL-12促进Th1细胞的分化[17,19]。与之相反，抗炎性或者是替代激活巨噬细胞(M2)在Th2型细胞因子（IL-4和IL-13）的环境中发育，通过IL-10和TGF-β发挥特殊的免疫调节作用，主要表现为选择性免疫抑制和抑制淋巴细胞增殖，在炎症慢性期及慢性疾病的损伤组织重塑修复中发挥免疫调节功能[14-1620]。M2型巨噬细胞表达丰富的甘露糖受体，另外，还可以特异地表达抗炎IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)，IL-1诱导受体(IL-1 decoy receptor)、替代巨噬细胞激活相关CC趋化因子1(AMAC-1)等。近年来，人们发现FIZZ1、YM1和精氨酸酶Ⅰ基因[21,22]（在替代激活巨噬细胞发挥功能时特异表达的基因）是M2型巨噬细胞存在的主要分子标志[14,23-24]。
　　我们推测，吸烟在敏感人群中可能通过诱导细胞因子分泌，抑制M2型巨噬细胞的活化，从而促进气道炎症进展和COPD的形成，而戒烟后随着肺内微环境细胞因子成分的改变，巨噬细胞的表型、功能可能也会发生转变;但是在吸烟不同阶段戒烟后炎性-抗炎性的免疫应答的转归，巨噬细胞分化的方向尚需深入研究;鉴于COPD戒烟前后气道黏膜炎症反应无明显改善，我们预计戒烟可能也不能改善M2抑制现象;也就是说在敏感人群中，吸烟是通过免疫调节异常促进了持续的炎症反应，并且和戒烟后持续存在的气道炎症反应关系密切。C57BL/6J小鼠对烟熏普遍敏感，国际通用烟熏24周建立肺气肿动物模型25-26]，本研究采用烟熏4周和24周后戒烟建立吸烟早期和肺气肿戒烟小鼠动物模型，所有小鼠均在SPF级环境中饲养，避免呼吸道感染，观察吸烟诱导气道炎症和烟熏肺气肿戒烟后小鼠肺组织病理形态学变化;以支气管肺泡灌洗液((bronchoalveolar lavagefluid，BALF)中炎症细胞的浸润和炎性-抗炎性细胞因子的表达来评价炎症反应的强度;分离纯化小鼠原代肺泡巨噬细胞，观察M2型巨噬细胞代表性基因FIZZ1和精氨酸酶Ⅰ的表达变化;比较两者之间的区别;探讨免疫调节机制在吸烟诱导的进行性发展的气道炎症反应中的作用，为COPD戒烟后持续炎症反应的发生提供理论依据。
　　实验方法:
　　1、实验动物熏烟
　　从中国医科大学附属盛京医院动物实验室购入雌性C57BL/6J小鼠，适应性喂养一周后开始实验。小鼠随机分为熏烟A组、B组和正常对照C组和D组，A组和B组分别用自制熏箱烟雾暴露4周和24周（每次烟雾暴露去过滤嘴香烟10支，每天两次，每次1小时余，每周5天），实验用烟为市售红金龙牌香烟（武汉卷烟厂生产，焦油含量15mg/支，烟气烟碱量1.1mg/支），正常对照组是仅将动物置入干净的熏箱于同样长时间，但不熏烟（C组4周，D组24周）。达累计熏烟时间后停止熏烟，A组在戒烟后7天和4周取材，B组在戒烟后3、5、7、10天和3、5、8周取材。
　　2、实验动物的病理检测
　　小鼠左肺以25cmH20压力灌注10％中性福尔马林缓冲液行气管内固定，再在10％中性福尔马林缓冲液内固定24-48小时，沿矢状面将其切割成2mm大小的组织块，常规石蜡包埋，制成4μm的切片，HE染色，根据Cosio[27]等设计的小气道病变评估方法和标准，选取直径在700-1200μm（管径最短径/最长径≥0.7）的膜性细支气管，由不知分组资料的两位病理科医生进行盲法阅片。参照Kawakami和Thurlbeck[28]方法，以平均线性截距(Lm)测量肺实质空气腔大小，确定肺气肿的形成。
　　3、采集肺泡灌洗液
　　小鼠深度麻醉，经BD静脉留置针气管插管并固定，用无菌生理盐水灌洗小鼠肺部，收集灌洗液后离心取上清液，-80℃的深度冰箱中保存，用于检测BALF中细胞因子的蛋白表达水平。
　　4、肺泡灌洗液中的细胞计数
　　将支气管肺泡灌洗液离心后得到的沉淀溶于生理盐水中，制成细胞悬液，显微镜下应用血细胞计数器直接计数总细胞数。取部分细胞悬液涂片，瑞氏染色，显微镜下分数中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，计算三种炎细胞的百分比。
　　5、支气管肺泡灌洗液中的炎性-抗炎性细胞因子的检测
　　应用酶联免疫反应检测BALF中炎性-抗炎性细胞因子的蛋白表达。包括:IL-1β、IL-12、IL-4、TGF-β、和IL-10。
　　6、原代肺泡巨噬细胞的分离纯化
　　小鼠麻醉，75％酒精消毒，固定于操作台，分离气管，BD留置针行气管插管并固定，抽取37℃含1％胎牛血清(FCS)的PBS1ml，缓慢推入气管，轻揉肺部，停留1 min后再回抽，以上操作重复10次，回收的支气管肺泡灌洗液移至超净台，注入带塞的离心管内，用200目的无菌滤网过滤，离心，沉淀的细胞团用RPMI1640培养液重悬洗涤细胞两次，离心，弃上清，再用含有10％FBS的RPMI1640培养液悬浮细胞，制成单细胞悬液，加至35mm培养皿内，充分混匀后在37℃、5％C02、饱和湿度的细胞培养箱内孵育24h，使巨噬细胞贴壁，PBS反复冲洗，除去未贴壁细胞，得到纯化的肺泡巨噬细胞(AM)。
　　7、原代巨噬细胞的鉴定:特异性表型MAC-3表达的免疫组织化学鉴定
　　向培养瓶中加入EDTA-2Na，以使贴壁细胞脱落，离心，RPMI1640洗涤，重悬，将纯化的AM粘附生长于盖玻片上，4％多聚甲醛溶液固定，0.1 M PBS洗涤，3％H2O2消除内源性过氧化物酶的活性，0.1 M PBS洗涤，正常兔血清封闭，滴加一抗（大鼠抗小鼠MAC-3单抗），4℃过夜，0.1 M PBS洗涤，滴加二抗(兔抗大鼠IgG)，37℃15min，DAB溶液显色，自来水终止，常规脱水、透明、封片，显微镜观察拍照。
　　8、M2型肺泡巨噬细胞代表性基因FIZZ1和精氨酸酶Ⅰ mRNA表达水平的检测
　　按照Trizol试剂说明书，提取纯化AM的总RNA;按照SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit说明书合成cDNA第一链。南京金斯瑞生物科技有限公司设计和合成FIZZ1、精氨酸酶Ⅰ（ArgⅠ）及内参GAPDH的特异性引物。应用SYBR GreenMaster mix扩增cDNA，通过ABI7500 thermocycler分析。
　　9、统计学分析
　　本研究应用SPSS16.0统计学软件进行分析，统计结果表述为平均数±标准差，采用单因素方差分析比较不同组的实验数据;当组间差异具有统计学意义时，采用LSD法进行组间比较， P＜0.05具有统计学意义。
　　实验结果:
　　1、小鼠肺组织气道病变在烟熏不同阶段戒烟后的转归和区别
　　(1)烟熏4周诱导肺组织气道炎症病变在戒烟后一周已经明显改善，4周时基本恢复到健康对照水平。
　　(2)烟熏24周小鼠的肺组织气道炎症病变比4周小鼠显著加重，肺泡隔断裂、肺泡腔扩大、平均线性截距显著增加，形成肺气肿;戒烟后直至8周，气道、血管周围和肺间质内的炎性细胞浸润仍较健康对照组显著。
　　2、小鼠在熏烟不同阶段戒烟后支气管肺泡灌洗液中炎症细胞分布的转归和区别
　　(1)烟熏4周小鼠BALF中细胞总数较正常对照小鼠明显增加，中性粒细胞(N)百分比显著增高，肺泡巨噬细胞(AM)百分比下降而淋巴细胞(L)百分比无显著差异。
　　(2)早期戒烟鼠N百分比在戒烟7天时明显下降，恢复到正常基线水平，而AM百分比反而增加，7天和4周没有显著差异，L百分比戒烟前后无显著区别。
　　(3)肺气肿小鼠BALF中细胞总数较正常对照小鼠和烟熏4周小鼠均明显增加，和烟熏4周小鼠相同，N百分比和L百分比显著增加，AM百分比下降。
　　(4)肺气肿小鼠BALF中细胞总数戒烟后8周仍不能恢复正常，并且AM百分比和L百分比直到戒烟仍和正常对照小鼠有显著差异，而N百分比在戒烟3周时恢复到正常水平。
　　3、炎性-抗炎性细胞因子在熏烟不同阶段戒烟后的转归和区别
　　(1)与正常对照组相比，烟熏4周小鼠肺组织匀浆中IL-1β、IL-4和TGF-β显著增加;IL-10也增高，但没有统计学意义(P=0.078); IL-12无显著区别。
　　(2)烟熏4周小鼠戒烟后7天增高的IL-1β和TGF-β比戒烟前显著下降，恢复到正常水平，而IL-4戒烟后无明显下降，4周时仍显著高于正常对照组;IL-10和IL-12戒烟前后没有显著改变。
　　(3)与正常对照组相比，烟熏24周小鼠BALF中IL-1β和IL-12显著高于正常对照小鼠，IL-10和TGF-β显著下降，IL-4无明显区别。
　　(4)烟熏24周小鼠IL-1β和IL-12均在戒烟3天时下降至正常水平，虽然IL-12有一过性再次增高，但不能持续，随戒烟时间延长仍能恢复，IL-1β在戒烟5和8周时甚至低于正常水平;相反，下降的IL-10和TGF-β戒烟后8周仍不能恢复;IL-4戒烟前后无差异。
　　4、M2型巨噬细胞在烟熏肺气肿小鼠戒烟后的转归
　　长期熏烟抑制M2型巨噬细胞的活化，肺气肿小鼠戒烟后3天有一过性的M2型巨噬细胞分化增多，恢复到健康水平;但是不能持续，戒烟后5天再次明显下降，并且一直到戒烟后8周仍不能恢复。
　　结论:
　　1、吸烟诱导的气道病变和炎症反应在早期戒烟时可逆。
　　2、吸烟诱导肺气肿后再戒烟，气道-肺病理损伤无明显改善，早戒烟机体获益更大。
　　3、戒烟可以明显改善肺气肿BALF中的炎细胞浸润，但是异常的肺泡巨噬细胞和淋巴细胞比例戒烟后持续存在。
　　4、戒烟对肺气肿的气道炎症反应有一定的缓解作用，但是不能完全恢复，只有部分细胞因子可以恢复到健康对照组水平，而IL-10和TGF-β仍显著低于正常对照组。
　　5、长期吸烟抑制M2型巨噬细胞的分化，一旦肺气肿形成，戒烟也不能使其恢复，可能是肺气肿持续进展气道炎症反应的机制之一。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 烟熏诱导的气道病变在早期戒烟和肺气肿戒烟后的转归

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 肺泡灌洗液中炎细胞和前炎性和抗炎性细胞因子在早期戒烟和肺气肿戒烟后的转归

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 烟熏肺气肿小鼠M2型巨噬细胞的表达及其在戒烟后的转变

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 自身免疫在慢性阻塞性肺疾病中的的研究

致谢

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