HSF1在LPS诱导大鼠发热过程中参与调节PO/AH区TRPV1基因的表达

摘要

目的：
　　机体的体温调节功能对于生命活动是非常重要的。当机体在感染等情况下会引起发热反应，即出现调节性体温升高。体温升高将影响到机体的许多正常功能活动，但是在一般情况下人体这种调节性的体温升高不会超过42℃，这说明体内存在着限制体温过高的调节机制。然而，关于体温调节中枢监测及调控体温的分子机制还不清楚。
　　瞬时感受器电位1(TRPV1)是近年来发现的具有温度感受特性的TRP家族成员之一，是一种主要允许Ca2+通透的阳离子通道。在体外，哺乳动物细胞的TRPV1可感受高于43℃的热刺激，辣椒素及某些内源性介质能够激活此通道。随后，人们在脑内多个部位发现了TRPV1的存在，其中包括重要的体温调节中枢视前区-下丘脑前部(PO/AH)。根据TRPV1感受的温度范围特点，提示PO/AH区的TRPV1可能参与机体发热时体温调控过程。但是，TRPV1作为体温调节的元件，调控其表达的分子机制还不清楚。
　　热休克反应(HSR)是生物体在热应激或其他应激状态下表现的以基因表达变化为特征的防御适应反应，在生物体中普遍存在，参与广泛的细胞机能的调节，具有重要的生物学作用。这一反应主要通过热休克转录因子1（HSF1）在转录水平调节相关蛋白的表达。HSF1已被公认为是机体重要的转录调节因子，在机体对抗多种应激刺激中起重要作用。
　　关于HSF1是否参与TRPV1对体温的调节作用目前尚无报道。我们推测存在于体温调节中枢PO/AH的TRPV1的表达可能受HSF1的调控，为此，我们应用生物信息学技术分析了TRPV1基因上游启动子-2133bp的区域有无HSF1的结合位点，结果发现了有3处HSF1的潜在结合位点。
　　为进一步明确发热时中枢体温调节的分子生物学机制，本研究采用LPS致大鼠发热模型及培养的大鼠神经胶质瘤细胞(PC12)，探讨了HSF1是否在LPS诱导大鼠发热过程中参与调控TRPV1基因的表达，并寻找在TRPV1基因上游启动子中HSF1的结合位点。
　　材料与方法：
　　1、细胞培养
　　大鼠神经胶质瘤细胞（PC-12）在含有10％FBS的DMEM培养基内，饱和湿度、37℃、5％CO2的培养箱内培养，用于后续的转染和双荧光分析。
　　2、基因组DNA提取及目的DNA的PCR扩增反应
　　应用蛋白酶K降解和连续的酚-氯仿萃取法提取大鼠PO/AH区细胞内的基因组DNA。应用PCR扩增技术得到6个近端位点相同，远端位点不同的TRPV1DNA片段，以翻译起始点ATG定位为-1，远端位点分别定位于-2123、-1425、-1160、-821、-394和-254。PCR反应中在这6条DNA片段的上、下游分别连接BglⅡ和MulⅠ限制性酶切位点。
　　3、将上述目的DNA片段克隆至pGL3增强型荧光报告基因质粒
　　首先将上述目的DNA片段克隆至pMD18-T simple质粒中，应用BglⅡ和MulⅠ双酶切及测序反应鉴定其长度是否准确，并进行碱基序列分析。应用BglⅡ和MulⅠ双酶切pMD18-T simple质粒，回收目的DNA，应用T4DNA连接酶将目的DNA序列克隆至pGL3增强型荧光报告基因质粒。
　　4、突变荧光报告基因质粒的制备
　　以pTRPV1/-1160荧光报告基因质粒作为模板，在HSE1元件中按照试剂盒说明书(Stratagene，La Jolla，CA)将碱基G突变成碱基T。
　　5、质粒的转染与活性检测
　　应用脂质体LipofectamineTM2000将萤光素酶报告基因质粒和对照质粒海肾荧光素酶(pRL-TK，内对照)转染至PC12细胞中。43℃热处理15min，37℃培养4h后应用双荧光素酶检测系统检测萤光素酶活性。
　　6、实验动物及分组
　　(1)对照组，向SPF级SD大鼠(license：SCXK(Liaoning)2008-0005)腹腔注射1mL生理盐水(n=12)。LPS组，向大鼠腹腔注射1mL LPS(80μg/kg，应用无菌生理盐水稀释，n=48)。
　　(2)PO/AH区样品的采集：对照组在注射生理盐水4h后采集，LPS组的样品采集分别在LPS注射后0h，2h，3h，4h和5h。
　　7、生物信号遥感术测量体温
　　应用10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，通过腹正中切口向腹腔内植入发射子(model TA-F40，Respironics-Mini Mitter,Bend，OR)并将其固定在腹壁上，关闭腹腔，恢复7天。应用BW-200生理无线遥测系统(Chengdu Technology and Market Corp.，LTD)测量基础体温和给药后的实时体温。
　　8、电泳迁移率分析(EMSA)检测HSF1与TRPV1基因启动子的结合
　　首先应用Thermo scientific公司的Biotin3'End DNA Labeling Kit标记含有HSE1反应元件的双链DNA探针。然后与反应液混匀后室温孵育20min。孵育结束后，每20μ1反应液中加入5μl5X Loading Buffer后混匀。样品应用4％预电泳的非变性聚丙烯凝胶分离，并检测样品的迁移状况。
　　结果：
　　1、克隆6条5'系列截短的大鼠TRPV1基因启动子序列
　　以大鼠PO/AH区基因组DNA为模板，克隆6条近端位点相同，远端位点分别位于-2123、-1425、-1160、-821、-394和-254(以翻译起始点ATG密码子定位为-1)的TRPV1DNA片段，并且这些片段的上、下游分别含有BgiⅡ和MulⅠ限制性酶切位点。
　　2、构建含有6条5'端系列截短的大鼠TRPV1基因启动子序列荧光报告基因
　　将上述6条5'端逐渐截短的DNA片段连接到pMD18-T simple质粒中。应用T4DNA连接酶将目的DNA序列克隆至pGL3增强型荧光报告基因质粒。
　　3、构建大鼠突变型TRPV1基因启动子报告基因
　　以pTRPV1/-1160荧光报告基因质粒作为模板，按照定点突变试剂盒说明书(Stratagene，La Jolla，CA)在HSE1元件中将碱基G突变成碱基T。
　　4、大鼠TRPV1报告基因活性的检测
　　(1)6个TRPV1基因启动子的5'端突变体片段，分别转染至PC-12细胞中，通过43℃、15min热应激处理，发现转染了包含pTRPV1/-2123、pTRPV1/-1425和pTRPV1/-1160片段质粒的细胞加热后转录活性明显升高，且三者之间没有明显的差异;而转染了包含pTRPV1/-821、pTRPV1/-394和pTRPV1/-254片段质粒的细胞加温后未检测到明显的转录活性。
　　(2)分别将含有野生型HSE1(con.HSE)和含有突变型HSE1(mut.HSE)结构的pTRPV/-1160转染至PC-12细胞。转染24h后细胞给予上述的热应激处理后检测启动子的活性。
　　结果显示，HSE1序列中G到T的突变完全阻断了加热诱导的转录。
　　5、LPS致热大鼠体温变化
　　与对照组比较，大鼠注射LPS后体温逐渐升高，在4h时出现发热高峰，AT为1.38±0.19℃(n=12，P＜0.01)，之后体温呈下降趋势。
　　6、LPS致热大鼠PO/AH区TRPV1的表达
　　在LPS诱导发热时，大鼠PO/AH区细胞TRPV1表达水平随着体温的升高明显升高，并在LPS处理4h时达到高峰。此后，随着体温的降低而下降，这一变化与大鼠的体温变化呈正相关（Y=1.298+4.410X，R=0.8047）。
　　7、LPS致热大鼠PO/AH区细胞HSF1活性
　　(1)采用Western-blot方法，检测了核内HSF1的表达量。
　　结果显示，核内HSF1的表达随体温的升高而逐渐增加，在LPS处理4h组HSF1的表达量升高最明显。此后，体温下降，HSF1的表达下调，这一变化与大鼠的体温呈正相关(Y=0.5892+0.2703X,R=0.8435)
　　(2)采用细胞核染色和HSF1免疫荧光染色，分析了LPS诱导发热过程中PO/AH细胞HSF1的亚细胞定位特征。
　　结果显示，在对照组中HSF1主要定位于细胞质，而LPS处理4h后，大量HSF1转移至细胞核中。
　　8、在LPS诱导大鼠发热时大鼠PO/AH区细胞中的TRPV1蛋白和HSF1蛋白的表达水平在体温升高时都相应的增加，二者之间呈现正相关关系(Y=0.5608X+0.1586,R=0.8919)
　　结论：
　　1、LPS诱导大鼠发热时，TRPV1的表达水平上调，并且与体温升高水平呈正相关。
　　2、LPS诱导大鼠发热时，HSF1的表达水平上调，与体温升高水平呈正相关，并且由细胞质向细胞核迁移。
　　3、在LPS诱导大鼠发热时大鼠PO/AH区细胞中的TRPV1蛋白和HSF1蛋白的表达水平在体温升高时呈现正相关关系(Y=0.5608X+0.1586，R=0.8919)
　　4、在PC12细胞中分别转染野生型和突变型TRPV1启动子报告基因，通过热应激刺激，显示TRPV1启动子中的HSE1序列是诱导TRPV1基因转录的关键元件，并证实HSE1位于TRPV1基因转录起始点上游-919～-910区域。
　　5、在LPS诱导大鼠发热时，体内HSF1结合于TRPV1基因上游启动子中的HSE1结合域。

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摘要

英文缩略语

论文一 LPS诱导大鼠发热过程中PO／AH区TRPV1和HSF1蛋白的表达

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 热应激时TRPV1基因上游启动子中HSE在调节基因转录中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 LPS诱导大鼠发热过程中HSF1参与PO／AH区TRPV1基因的表达

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 瞬时感受器电位香草酸亚型1(TRPV1)的温度敏感特性和在体温调节中的作用

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