寡核苷酸探针延伸特异性研究

摘要

前言:
　　 SNPs全称单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms),是指在基因组上单个核苷酸的变异形成的遗传标记,其数量很多,多态性丰富。SNPs作为第三代遗传标记,对其分析有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病,特别是对复杂疾病的易感性、药物的耐受性和环境因子的反应,因此其广泛应用于分子诊断、临床检验、法医学、病原检测、遗传疾病和新药研发等[1]。
　　 基因芯片作为一种高通量的检测手段,诞生至今,对生命科学研究产生了巨大的推动作用。高通量、并行化检测的特点使其在基因分型[2],遗传变异,致病基因的定位[3]和遗传病的筛查等多方面都显示出了独特的优势。
　　 目前已知的SNPs检测技术种类繁多,为实现其高通量的检测,将SNPs检测技术与芯片技术结合使用是常用的方法之一,通常使用的方法包括特异探针杂交及在片单次延伸反应。然而,单纯依靠杂交区分单个碱基差异十分困难,其各个探针对杂交和洗脱条件的要求极为苛刻,高通量难以实现;而单次载片延伸通常采用等位基因特异性引物作为延伸探针,其特异性随不同序列变化极大,严重限制该方法的应用[4]。
　　 本研究以乙肝病毒S蛋白基因序列为模板,将近年来新提出的一种引物设计思路,即两段式引物(DPO)[5]引入SNPs位点的检测中,该引物特异性较好,可较为有效的区分SNPs位点,其或可为载片延伸探针的发展提供新的思路。
　　 材料及方法:
　　 一、实验材料
　　 PCR试剂盒(NEB)
　　 VentR-(exo-)DNA聚合酶(NEB)聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒(OMEGA)
　　 PCR扩增仪(BiometraPersonalPCRsystem,Germany)
　　 生物芯片点样仪(MicroGrindⅡ600,BiorobticsLtd,England)
　　 激光共聚焦扫描仪(GeneTACTMLSIV,GenomicSolutionsInc.USA)
　　 原位延伸芯片盒(实验室自制)
　　 二、实验方法
　　 1.应用生物信息学软件设计通用引物;针对HBVC亚型基因SNPs位点设计探针。
　　 2.用PCR方法在液相中验证位点限制性引物。
　　 3.通过杂交与载片延伸验证传统探针特异性。
　　 4.用PCR方法于液相中验证DPO探针特异性
　　 结果:
　　 1.传统探针在检测SNPs时特异性不佳
　　 2.新型引物特异性较高,且可在较宽的退火温度范围内保持特异性。
　　 结论:
　　 相比较传统引物而言,DPO引物在区分SNPs位点上面显示出更高的特异性,且其实验条件更易优化。