胃癌中COL4α3和BTG3表达的临床病理意义及相关分子机理

摘要

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。近年来分子遗传学研究证明，胃癌是异型性极强的恶性肿瘤，胃癌发生和发展是多阶段、多基因、多因素参与的复杂过程，这些基因主要包括癌基因、抑癌基因及DNA错配修复基因等。研究癌变和演进标志物及相关分子机理将对胃癌早期诊断具有重要意义，也将推动胃癌个性化治疗和靶向基因治疗的发展。
　　 COL4α3（胶原Ⅳα3链、肺出血肾炎抗原）属Ⅳ型胶原家族，分布具有组织特异性。最近的研究表明，Ⅳ型胶原具有细胞粘附功能，参与肿瘤侵袭和转移。近年来，研究发现多条Ⅳ型胶原α链的非胶原域(NC1区)具有抑制血管生成和肿瘤生长的作用。Tumstatin（肿瘤抑素）是人COL4α3 NC1区。多项研究表明，tumstatin不但能够通过抑制肿瘤血管生成抑制肿瘤生长，而且能够直接抑制肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡。
　　 BTG3基因是TOB/BTG基因家族的成员之一，研究发现这一基因家族在抑制癌细胞增殖、调节细胞周期和分化方面发挥重要作用，被称为抑癌基因家族。已有研究表明，BTG3参与细胞分化、发育、凋亡、肿瘤细胞抑制等各种生理及病理过程并发挥着重要的作用。BTG3通过蛋白-蛋白相互作用将细胞外的信号传递到细胞核内，进而发挥其抑癌基因的作用。
　　 综上所述，在对COL4α3和BTG3基因功能进行深入研究后，联合构建tumstatin和BTG3的慢病毒载体，应用到胃癌的靶向基因治疗，如果实施顺利将会对胃癌的三早防治提供科学的理论依据和实验基础，并且具有不可估量的社会应用价值。
　　 材料与方法：
　　 1、培养胃癌细胞，利用RT-PCR检测各种细胞中的COL4α3和BTG3 mRNA水平，Western蛋白印迹检测各种胃癌细胞COL4α3和BTG3蛋白表达。
　　 2、应用RT-PCR和实时PCR检测胃癌新鲜标本COL4α3和BTG3的mRNA水平，Western蛋白印迹检测新鲜胃癌标本COL4α3和BTG3蛋白表达。构建组织芯片后免疫组织化学检测胃癌中COL4α3和BTG3蛋白表达，分别比较两种蛋白表达与胃癌临床病理生物学行为及预后的关系。
　　 3、MTT实验检测tumstatin(185-203)合成肽对胃癌细胞增殖情况的影响。并分别构建特异分泌蛋白PGC（胃主细胞特异蛋白）、SLPIT（胃癌特异分泌蛋白）和PNCMO2（原核分泌信号肽）信号肽-tumstatin(185-203)-His标记蛋白重组蛋白表达慢病毒载体。设计引物进行高保真PCR，分别将PGC、SLPIT和PNCMO2三种信号肽-tum-his连接到载体pBlueScript SK(+)上，将此三种质粒分别命名为PGC-T、SLPIT-T、pNCMO2-T。分别以PGC-T、SLPIT-T或者pNCMO2-T为模板，通过PCR分别扩增三种信号肽、tumstatin的cDNA和His标签相连接的长序列并纯化待用。EcoRV酶切慢病毒载体并去磷酸化后，与已纯化待用的三种PCR产物分别进行连接。将预期连接上的质粒转化，然后进行菌落克隆PCR扩增，鉴定连接质粒。最后送生物公司进行测序。
　　 4、合成BTG3 siRNA，siRNA转染BTG3mRNA水平高的MGC-803和SGC-7901胃癌细胞系，利用RT-PCR检测siRNA干扰对胃癌细胞BTG3mRNA表达的影响;Western蛋白印迹和免疫荧光检测siRNA干扰对胃癌细胞蛋白表达的影响。
　　 5、分别提取胃癌细胞和组织中的基因组DNA，进行BTG3启动子甲基化检测。并在细胞培养液中加入5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷抑制BTG3基因启动子甲基化，同时利用RT-PCR检测干扰前后细胞mRNA水平。
　　 6、以不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG132处理胃癌细胞，利用Western蛋白印迹和免疫荧光检测MG132处理SGC7901和MGC-803胃癌细胞前后BTG3蛋白表达变化。MTT实验检测MG132对SGC7901胃癌细胞增殖情况的影响。
　　 7、构建含有BTG3 cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-BTG3-his的重组质粒。将构建的BTG3质粒稳定转染至培养的SGC7901胃癌细胞系，筛选单克隆细胞，应用RT-PCR检测mRNA水平，Western蛋白印迹检测BTG3和His蛋白表达。
　　 结果：
　　 1、胃癌细胞系中COL4α3mRNA及蛋白表达正常胃粘膜细胞系GES-1和胃癌细胞系MKN28、MKN45、AGS、KATOⅢ、GT-3TKB、HGC-27、MGC-803、BGC-823、SGC-7901、STKM2和SCH中，COL4α3mRNA在KATO-Ⅲ、MGC-803、MKN45和SCH细胞系中呈强表达;在GES-1、AGS、BGC-823、GT-3 TKB、MKN28、SGC-7901和STKM-2细胞系中呈弱表达;在HGC-27细胞系中表达缺失。162KDa COL4α3蛋白在KATO-Ⅲ、MKN28和MKN45细胞系中呈强表达;在GES-1、AGC、BGC-823、GT-3 TKB、MGC-803、SCH、SGC-7901和STKM-2细胞系中呈弱表达;在HGC-27细胞系中表达缺失。
　　 2、胃癌冰冻组织标本中COL4α3 mRNA及蛋白表达18例胃癌冰冻样本有15例胃癌组织COL4α3 mRNA表达水平低于癌旁正常胃粘膜组织，但有3例高于癌旁正常胃粘膜组织。统计分析显示，胃癌组织COL4α3 mRNA表达水平低于正常胃粘膜(P＜0.05)。所有胃癌组织中均检测到162kDaCOL4α3蛋白表达，胃癌组织和癌旁正常胃粘膜组织中COL4α3蛋白表达水平无显著差异（P＞0.05）。我们仅在3例胃癌样本及2例正常胃粘膜样本中检测到28kDa tumstatin蛋白表达。
　　 3、胃癌组织中COL4α3表达及与临床病理特征的关系免疫组化染色结果显示，COL4α3蛋白主要定位在胃浅表粘膜、深部固有腺体、肠化生和胃癌细胞浆中，偶见于粘液中。COL4α3蛋白表达在胃炎为4.3％(3/70)、胃粘膜肠化生为100.0％(23/23)、胃癌旁肠化生为100.0％(140/140)、胃癌为36.7％(151/411)。统计学分析显示，肠化生组织COL4α3蛋白表达明显高于胃炎和胃癌组织（P＜0.05），而胃癌高于胃炎(P＜0.05)。COL4α3蛋白表达与胃癌肿块大小、淋巴管侵袭、静脉侵袭和TNM分期呈正相关;弥漫型胃癌中COL4α3表达高于肠型胃癌（P＜0.05）。组织学上所有印戒细胞癌和粘液腺癌均表达COL4α3。生存分析表明所有或进展期胃癌中COL4α3表达与胃癌不良预后呈正相关，但不是独立的预后因素。
　　 4、MTT实验检测tumstatin合成肽对胃癌细胞增殖情况的影响加入不同浓度tumstatin(189-203aa)合成肽处理MGC-803、BGC-823和SGC-7901三种胃癌细胞，MGC-803和SGC-7901两种胃癌细胞的增殖率随tumstatin合成肽浓度的升高有降低趋势(P＜0.05)，而BGC-823胃癌细胞的增殖率未受到影响。
　　 5、分别成功构建了胃癌细胞能处理的特异分泌蛋白PGC（胃主细胞特异蛋白）、SLPIT(胃癌特异分泌蛋白)和PNCMO2(原核分泌信号肽)信号肽-tumstatin(185-203)-His标记蛋白重组蛋白表达慢病毒载体。
　　 6、胃癌细胞和新鲜冰冻组织中BTG3 mRNA及蛋白表达在胃癌细胞系AGS、KATO-Ⅲ、MGC-803、MKN28、MKN45、SCH和STKM-2中有BTG3蛋白的表达;除HGC-27胃癌细胞，BTG3 mRNA在其他胃癌细胞系及胃粘膜上皮细胞GES-1中均有表达。胃癌组织中BTG3蛋白表达低于癌旁正常胃粘膜(P＜0.05），而胃癌组织中BTG3 mRNA表达高于癌旁粘膜(P＜0.05)。
　　 BTG3 siRNA干扰BTG3 mRNA水平高的胃癌细胞系MGC-803和SGC-7901。结果显示，BTG3 siRNA抑制了两种胃癌细胞中BTG3 mRNA表达，但是蛋白表达没有显著下降。
　　 7、胃癌细胞和新鲜冰冻组织标本中BTG3启动子甲基化检测我们针对两个BTG3启动子位点设计了甲基化和非甲基化引物。结果显示，胃粘膜上皮细胞CES-1和11种胃癌细胞均存在启动子甲基化。胃癌组织与正常胃粘膜组织比较，启动子甲基化水平无明显差异（P＞0.05）。
　　 5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷处理GES-1、AGS、BGC-823、KATO-Ⅲ、MGC-803和MKN28细胞后，细胞BTG3mRNA表达水平增高，启动子CpG甲基化减弱和（或）去甲基化产物增多。
　　 8、蛋白酶体抑制剂MG132处理胃癌细胞系，观察MG132对胃癌细胞BTG3蛋白表达和细胞增殖力的影响。
　　 MG132可以增加胃癌细胞系SGC7901和MGCS03中BTG3蛋白表达，并且呈剂量依赖性（P＜0.05）。随MG132浓度的增加，SGC7901细胞增殖力呈现下降趋势。
　　 9、胃癌组织中BTG3表达及与临床病理特征的关系免疫组化染色结果显示，BTG3蛋白主要定位在胃浅表粘膜细胞浆中、深部固有腺体及胃癌的细胞质中。胃癌组织中BTG3表达较正常胃粘膜明显减少(P＜0.001);胃癌组织BTG3表达与静脉侵袭呈正相关，但是与患者年龄、性别、侵袭深度、淋巴侵袭、淋巴结转移、远处转移或者胃癌的TNM分期无关。
　　 10、成功构建了含有BTG3基因的真核表达载体pcDNA3.1-BTG3-his重组质粒，并稳定转染入SGC7901细胞。
　　 结论：
　　 1、胃癌组织COL4α3 mRNA表达低于其邻近正常胃粘膜组织。单纯肠化生和癌旁肠化生组织中COL4α3蛋白表达高于胃癌组织。
　　 2、胃癌中BTG3 mRNA高表达、蛋白低表达可能与蛋白酶体的调控有关。
　　 3、在胃癌和癌旁正常组织中BTG3甲基化无明显区别。用5-Aza处理肿瘤细胞后，发现BTG3mRNA水平升高。这些结果提示在胃黏膜和胃癌中BTG3的甲基化是普遍存在的，并且是BTG3表达沉默的分子机制之一。
　　 4、COL4α3和BTG3的异常表达可能影响胃上皮细胞的恶性转化，可作为胃癌发生和侵袭的生物学标记物。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 胃癌发生和演进中COL4α3蛋白及其降解产物tumstatin作用及相关分子机制的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 BTG3变体在胃癌中表达的意义及相关分子机制

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

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